Тирозин фосфатаза – Антитела к тирозинфосфатазе (IA-2), IgG

Содержание

Антитела к тирозинфосфатазе (IA-2, Islet tyrosine phosphatase, Islet Cell Antigen IA-2, ICA512 Antibodies)

Метод определения

Иммуноферментный анализ.

Исследуемый материал Сыворотка крови

Доступен выезд на дом

Антиген IA-2 (insulinoma associated antigen) является специфичной для поджелудочной железы тирозинфосфатазой, которая участвует в регуляции секреции инсулина. Антиген накапливается в секреторных гранулах нейроэндокринных клеток, а также бета-клеток островков Лангерганса, где он включен в регуляцию секреции инсулина.

Антитела к тирозинфосфатазе IA-2 являются маркером сахарного диабета 1-го типа, их присутствие выявляют у 50-70% пациентов (детей и подростков) в дебюте заболевания. Частота их выявления уменьшается после дебюта заболевания, как и частота выявления других серологических маркеров сахарного диабета. 

Исследование антител к IA-2 используют в прогнозировании риска развития сахарного диабета у родственников больных совместно с определением антител к GAD (№202), ICA (№201) и антител к инсулину (№200). В связи с низкой встречаемостью, выявление антител к тирозинфосфатазе не обладает достаточной информативностью при минорных клинических формах сахарного диабета.

Литература

  1. Лапин С.В., Тотолян А.А. Иммунологическая лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний. Издательство «Человек», СПб — 2010.
  2. Tietz Clinical guide to laboratory tests. 4-th ed. Ed. Wu A.N.B.- USA,W.B Sounders Company, 2006,1798 p.
  3. Conrad K., Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantibodies in Organ Specific Autoimmune Diseases: A Diagnostic Reference/ PABST, Dresden – 2011.
  4. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantibodies in Systemic Autoimmune Diseases: A Diagnostic Reference/ PABST, Dresden – 2007.
  5. Gershvin M.E., Meroni P.L., Shoenfeld Y. Autoantibodies 2nd ed./Elsevier Science – 2006.
  6. Shoenfeld Y., Cervera R., Gershvin M.E. Diagnostic Criteria in Autoimmune Diseases / Humana Press – 2008.
  7. Материалы фирм-производителей наборов реагентов.

www.invitro.ru

Тирозин-фосфатаза SHP2, улучшающая функциональную мутацию, усиливает злокачественность карциномы молочной железы

A tyrosine phosphatase SHP2 gain-of-function mutation enhances malignancy of breast carcinoma
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4868712/

Предпосылки: данные свидетельствуют о том, что мутанты гомологичных белков фосфотирозилфосфатазы 2 (SHP2) Src способствуют развитию рака в нескольких твердых опухолях. В этом исследовании мы сосредоточились на in vivo и in vitro эффектах мутации SHP2 на фенотипе рака молочной железы, чтобы определить, коррелирована ли эта мутация со злокачественным фенотипом.

Методы: кДНК мутантного PTPN11 (D61G) трансдуцировали в клетки MDA-MB231 и MCF-7. Были исследованы эффекты мутации D61G на опухолегенез и злокачественное поведение, такие как адгезия клеток, пролиферация, миграция и инвазия. Были также исследованы потенциальные молекулярные механизмы, то есть активация оси Габ-Рас-Эрк.

Результаты:
Эксперименты in vitro показали, что адгезия опухоли, пролиферация, миграция и инвазия были значительно увеличены в мутантных группах SHP2 D61G. Впоследствии эксперименты in vivo также показали, что размеры и вес опухоли значительно увеличились в группе SHP2 D61G-MB231 (p

Вывод: мутантный SHP2 значительно способствует миграции опухолей и инвазии, по крайней мере частично, путем активации оси Габ-Ра-Эрк. Этот вывод может иметь прямые последствия для терапии рака молочной железы.

Рак молочной железы — наиболее распространенная злокачественная опухоль, поражающая женщин во всем мире. Это вторая ведущая причина смертности от рака у женщин в США. Важнейшими факторами, способствующими этой высокой смертности, являются метастазы и рецидивы. Исследования сообщают о сверхэкспрессии Src гомологичной белковой фосфотирозилфосфатазы 2 (SHP2SHP2) в тканях рака молочной железы. Однако роль сигнального пути SHP2 в злокачественной прогрессировании рака молочной железы остается неизвестной.

Белки тирозинфосфатаза (PTP) SHP2 кодируется геном PTPN11, который передает сигналы от рецепторов фактора роста в Ras и другие эффекторы [1, 2]. SHP2 представляет собой беспембранный ПТП, в значительной степени положительный регуляторный характер в сигнальной трансдукции многих факторов роста, цитокинов и гормонов. Сообщалось, что доминантный отрицательный SHP2 нарушает гаструляцию Xenopus и вызывает усечение хвоста [3, 4]. Показано, что целенаправленное удаление экзона 3 SHP2 приводит к уменьшению клеточного распространения и миграции [5, 6] и нарушению развития конечностей у химерных мышей [7]. Роли SHP2 в клеточной адгезии и миграции также были продемонстрированы с использованием каталитически неактивных SHP2SHP2-сверхэкспрессирующих клеток [8, 9]. Однако молекулярные механизмы, с помощью которых SHP2 способствует этим клеточным процессам, не были четко определены. Например, роль SHP2 в активации членов семейства Rho малого GTPases, которые имеют решающее значение для подвижности клеток, остается спорной. В этом контексте сообщается о положительных [2, 10] и отрицательных ролях [11, 12] SHP2. Это расхождение может быть связано с различиями в моделях клеток, используемых в анализах. В клетках, экспрессирующих каталитически неактивный SHP2SHP2, каталитическая активность эндогенного SHP2 ингибируется. Однако, поскольку SHP2 также функционирует независимо от его каталитической активности, сверхэкспрессия каталитически дефицитного SHP2 может увеличить его функцию лесов [13, 14].

Модификации GF-функции (GOF) в SHP2 приводят к дисрегуляции множественных путей передачи сигналов, тем самым способствуя развитию различных человеческих расстройств [15]. Исследования показали, что мутации GOF PTPN11 достаточны для развития подросткового миеломоноцитарного лейкоза (JMML) -подобного миелопролиферативного расстройства и злокачественного острого лейкоза у мышей. Следует отметить, что большинство человеческих SHP2SHP2 мутаций происходят в N-Sh3 или PTP-домене и включают удаление остатков, которые участвуют в базальном ингибировании. Наиболее распространенными мутациями SHP2 GOF являются D61G [16] и E76D, которые присутствуют примерно у 50% пациентов с синдромом Ноонана (NS), расстройством развития, связанным с повышенным риском развития JMML [17, 18]. Фенотипы, возникающие в результате потери функции SHP2, объясняются ролями SHP2 в клеточных сигнальных путях, вызванных факторами роста и цитокинами [19, 20]. SHP2 обычно способствует передаче сигнала во время сигнала фактора роста / цитокинов как в каталитически-зависимых, так и в каталитически-независимых манерах [21, 22]. Положительная роль SHP2 в процессах внутриклеточной передачи сигналов, особенно пути киназы MAPK-PI3K, была хорошо установлена. Однако точный основной механизм остается неуловимым [23, 24]. Кроме того, было обнаружено, что соматические мутации GOF в гене PTPN11 обычно встречаются в некоторых твердых опухолях, таких как карцинома толстой кишки, рак молочной железы, рак легких, рак щитовидной железы, меланома и нейробластома [15, 25, 26]. Однако способ, с помощью которого мутации GOF в SHP2 индуцировать эти фенотипы, до конца не до конца понят. В этом исследовании мы ввели мутацию GOF в SHP2 в клеточных линиях рака молочной железы, и эти клеточные линии использовали для исследования роли мутаций GOF в SHP2 при злокачественном поведении опухолей молочной железы in vitro и in vivo. Наши результаты дают новое представление о потенциальной роли SHP2 в онкогенезе груди, а также свидетельствуют о том, что подавление чрезмерной экспрессии SHP2 или активности может быть новой терапевтической стратегией для пациентов с раком молочной железы.

Мы исследовали экспрессию SHP2 в каждой из трансдуцированных популяций. После трансфекции pcDNA3.1 или pcDNA3.1SHP2SHP2D61G в культуре были расширены G418-устойчивые клоны MDA-MB231 и MCF-7. Через четыре недели было выбрано 6 колоний для исследования экспрессии SHP2 с помощью вестерн-блот-анализов. Как показано на фиг. 1А, положительная экспрессия SHP2 была обнаружена в клетках, трансдуцированных с мутантной SHP2-плазмидой. Трансфекция была подтверждена секвенированием ДНК выбранных клонов (рисунок 1). Уровень белка SHP2 был нормализован до уровня конститутивно экспрессированного белка β-актина с помощью денситометрии (рис. 1B). Для исследования влияния мутантного SHP2 на развитие опухоли клоны с аналогичными уровнями экспрессии SHP2 в качестве контрольной группы были выбраны для дальнейшего изучения. Кроме того, измеряли активность фосфатазы, и результаты показали, что она была увеличена в группах мутантов по сравнению с контрольными группами.

А. Вестерн-блот-анализ проводили для проверки экспрессии SHP2 после трансфекции в клетках MCF-7 (верхняя панель) и клетках MB-231 (нижняя панель). B. Полосы были проанализированы с помощью ImageJ. Представлено отношение экспрессии SHP2 к актину. Полоски с красными стрелками показывают аналогичные уровни экспрессии SHP2 по сравнению с клетками дикого типа, и эти клетки были выбраны для будущих экспериментов. C. Были проведены анализ Вестерн-блоттинга и IP для подтверждения экспрессии SHP2 в колониях, которые были выбраны для дальнейших экспериментов. Данные представлены как среднее ± SD.

Мы исследовали возможности клеток SHP2SHP2-D61G-MB231 и MCF-7 для присоединения к FN. Клетки высевали в 96-луночные планшеты, предварительно покрытые FN, и инкубировали в течение 30 мин, 60 мин или 2 ч, соответственно. После удаления неадгезивных клеток путем промывки PBS прикрепленные клетки окрашивали кристалловым фиолетовым и измеряли поглощение клеток MCF-7 (фиг. 2A) и клеток MB-231 (фиг. 2B) при 499 нм. Трансфекция мутанта SHP2-D61G значительно увеличивала адгезию клеток MCF-7 и MB-231 через 2 часа. Количество адгезивных клеток было сходным в непереведенных и векторных линиях MB231. Тем не менее, мутантные клетки оказались более удлиненными, тогда как клетки, не трансфицированные и вектор-MB231, не распространялись или удлинялись широко и оказывались меньшими (морфология клеток была продемонстрирована только для клеток MB-231, фиг. 2C).

A. и B. FN-клеящие клетки были обнаружены путем окрашивания кристаллов-фиолетовыми; значения оптической плотности сравнивались при 490 нм для оценки адгезии различных групп клеток MCF-7 (A) и MB-231 (B). C. Морфологическая оценка клеящих клеток при большом увеличении, оригинальное увеличение составило 400 ×. Данные представлены как среднее ± SD. Проведены три независимых эксперимента. * p

Для всестороннего изучения эффектов SHP2SHP2 на развитие и прогрессирование опухоли была проведена миграция клеток MB-231 и MCF-7 (рисунок 3). Клетки высевали в верхнюю камеру трансвельберной системы и позволяли мигрировать в нижнюю камеру через небольшие поры мембраны (8 мм). Клетки, которые пересекали мембрану, подсчитывали через 12 ч для клеток MB-231 и через 24 часа для клеток MCF-7. Количество мигрированных клеток в группах мутантов было значительно увеличено как для клеток MB-231, так и для MCF-7 по сравнению с контрольными и трансфицированными векторами клетками (фиг. 3A и 3B; p

A. и B. Кристаллическое фиолетовое окрашивание мембраны после миграции камеры Boyden было представлено в клетках MCF-7 и MB-231. C. и D. Значения оптической плотности сравнивались при 490 нм для оценки миграции различных групп клеток MCF-7 и MB231. Данные представлены как среднее ± SD. Проведены три независимых эксперимента. * p

А. В анализе трансверсальности инвазивность была количественно оценена путем оценки миграции клеток через Матригель в нижнюю часть камеры. B. Было подсчитано общее количество клеток, которые пересекали мембрану. Положительно окрашенные клетки подсчитывали и анализировали случайным выбором 10 HPV для каждой группы. C. Эксперимент по культуре 3D Matrigel показал инвазивность клеток MB231, которые экспрессировали мутантный SHP2. D. Статистический анализ результатов 3D-культуры. Данные представлены как среднее ± SD. Все эксперименты выполнялись три раза независимо, * p

Для дальнейшей характеристики эффектов мутантного SHP2SHP2 на клетках MDA-MB231 были проведены дополнительные исследования для изучения его роли в опухолегенезе. Анализ in vitro включал измерение образования фокусов, которое отражает увеличение роста, зависящего от плотности, или измерение независимого от фиксации роста в мягком агаре, как описано выше. Как клетки SHP2 MB-231, так и SHP2 MCF-7 демонстрировали значительно улучшенное образование фокусов, так как множественные очаги образовались в мутантных группах SHP2SHP2 по сравнению с контрольными группами (дополнительный рисунок S2A и S2B). Анчограционные независимые анализы роста, изучающие рост колоний в мягком агаре, выявили наличие большего количества колоний клеток SHP2-D61G-MB231 и MCF-7 по сравнению с клетками контрольных клеток (дополнительный рисунок S2C-S2E).

Увеличенное количество колоний и размер колонии, наблюдаемые в анализе образования колоний, дали дополнительные доказательства, подтверждающие представление о том, что мутация SHP2 D61G приводит к более высоким темпам самообновления и пролиферации по сравнению с клетками, трансфицированными векторами, что приводит к высокой скорости опухолевого генеза.

Чтобы дополнительно подтвердить наблюдаемые in vitro эффекты мутации GOF SHP2SHP2 на пролиферацию, жизнеспособность и инвазивность клеток рака молочной железы человека, мы исследовали его роли в росте и метастазировании опухолей молочной железы in vivo с использованием модели ксенотрансплантата опухоли. Клетки аденокарциномы молочной железы человека вводили в мышей BALB / c. Опухоли молочной железы были обнаружены примерно через 1 неделю после первоначальной имплантации (рисунок 5). Мутация SHP2 GOF улучшала рост опухоли в группах MB231 (рис. 5A-5D) и MCF-7 (рисунок 5E-5G). Как показано на фиг.5А и 5Е, скорость роста опухолей молочной железы из клеток SHP2 MB231 была значительно выше, чем у опухолей из контрольных клеток. Опухоли молочной железы были удалены через 50 дней для дальнейшего измерения. Как показано на фиг.5В и 5С, мутация SHP2 GOF значительно увеличивала вес опухолей молочной железы. Аналогичные результаты наблюдались с использованием клеток MCF-7.

A. Репрезентативное изображение, показывающее опухоли молочной железы из группы (верхняя панель) и группы SHP2 (нижняя панель) для клеток MB231. Изображения были захвачены в момент жертвоприношения. B. Размер опухоли контролировали каждые 10 дней после имплантации клеток MB-231 и рассчитывали, как указано в разделе «Материалы и методы». C. Твердые опухоли из клеток MB-231 удаляли, и их веса определяли после жертвоприношений. D. Оценивали метастазы опухолей в отдаленные органы. E. Репрезентативный образ, показывающий опухоли молочной железы из группы (верхняя панель) и группы SHP2 (нижняя панель) для клеток MCF-7. Изображения были захвачены в момент жертвоприношения. F. Размер опухоли контролировали каждые 10 дней после имплантации клеток MCF-7. G. Твердые опухоли из клеток MB-231 удаляли, и их веса определяли после жертвоприношений. Данные представлены как среднее ± SEM (n = 6 / группа) * p

Далее мы определили, способствует ли мутация SHP2 GOF метастазированию опухолей молочной железы. Метастаз внутренних органов оценивали гистологическим анализом. Как показано на рисунках 5D и S3 и таблице 1, узлы метастатической карциномы почек, печени и легких были обнаружены у всех 6 мышей в группе SHP2 D61G-MB231, тогда как метастазы не были идентифицированы ни у каких животных в группе вектор-MB231.

Многие исследования показали, что SHP2 требуется для трансляции сигналов в нисходящие пути MEK / ERK и PI3K / AKT для трансформации клеток [23, 24, 27]. Поэтому мы изучили активацию MEK / ERK и PI3K / AKT-зависимых киназ после активации мутантного SHP2. Вестерн-блот-анализ проводили для изучения уровней фосфорилированного Erk и AKT. Мутация SHP2 GOF в клетках MDA-MB231 привела к быстрому и резкому увеличению уровней сигнальных молекул, включая p-Erk и p-AKT (рис. 6). И наоборот, ингибиторы MAPK и PI3K LY294002 и SB203580 блокировали активацию p-AKT и p-ERK (рис. 6C), что привело к снижению адгезионной способности клеток MB231 в группе SHP2 D61G (рис. 6D и 6E).

Клетки замораживали в течение ночи и стимулировали в DMEM с 10% FBS в течение 2 часов. Стимуляция EGF индуцировала фосфорилирование тирозина SHP2. Клетки инкубировали в течение 5 мин и 15 мин в присутствии или отсутствии EGF (5 нг / мл). Ароматическую активацию А. Эрка и АКТ определяли путем вестерн-блоттинга. B. Фосфотирозин (PY) был обнаружен в цельноклеточных лизатах (WCL). C. Вестерн-блоттинг проводили для выявления активации p-AKT и p-ERK после лечения LY294002 и SB203580. (D и E) FN-адгезивные клетки MCF-7 визуализировали D. и подсчитывали E. после обработки LY294002 и SB203580. Положительно окрашенные клетки подсчитывали и анализировали случайным выбором 10 HPV для каждой группы. Данные представлены как среднее ± SEM (n = 6 / группа) * p

Более ранние исследования показали, что усиленная активация ERK и Akt коррелирует с увеличением взаимодействия между мутантным SHP2 (SHP2 D61G) и белком леса Ga1. Напротив, был сообщен мутант Gab1, который не может связывать SHP2, который не потенцирует активность MAPK [28]. Таким образом, мы стремились определить, может ли мутация GOF в SHP2 активировать активацию p-AKT и p-ERK путем изменения взаимодействия Gab1 и SHP2 в нашей системе. Раковые клетки молочной железы были лишены сыворотки в течение 24 ч, после чего стимулировали EGF в течение различных промежутков времени. Интересно, что мы обнаружили, что связывание между Gab1 и SHP2 было конститутивно повышенным по сравнению с тем, что между Gab2 и пустым вектором в клетках MB-231 (фиг. 7A-7C и 7E) и клетках MCF-7 (дополнительный рисунок S4). Gab1 siRNA использовалась для подтверждения этого открытия, и мы обнаружили, что обработка клеток с помощью γ1 siRNA значительно уменьшала связывание между Gab1 и SHP2, что приводило к понижающей регуляции активации p-Erk и p-AKT (рис. 7C) , Более интересно, деактивация пути Рас-Эрка привела к снижению адгезионной способности клеток MB231 (рис. 7D).

A. Активация PY была обнаружена в WCL из мутантных клеток SHP2. B. Проводили анализ иммунопреципитации для оценки взаимодействия между Gab1 и SHP2. C. Активация p-Erk и p-Akt была обнаружена вестерн-блоттингом после молчания экспрессии Gab1. D. Адгезия клеток MB-231 была обнаружена после молчания экспрессии Gab1 с использованием siRNA. E. SHP2, Gab1 и Gab2 идентифицировали с использованием специфического антитела после лечения EGF. Положительно окрашенные клетки подсчитывали и анализировали случайным выбором 10 HPV для каждой группы. Данные представлены как среднее ± SEM (n = 6 / группа) * p

В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что мутация SHP2 способствует увеличению связывания между SHP2 и Gab1, тем самым увеличивая активацию пути Рас-Эрка.

Результаты настоящего исследования показали, что мутант D61G, известный мутант GOF SHP2, усиливает взаимодействие между Gab1 и SHP2 и увеличивает активацию пути MAPK-PI3K, что, в свою очередь, способствует миграции опухолей и инвазии и другим злокачественным формам поведения.

Мутации соматических SHP2 являются основными причинами JMML, NS и нескольких твердых опухолей [15, 25, 26]. Предыдущие исследования показали, что мутации SHP2 GOF важны для патогенеза этих заболеваний. Однако биохимические функции этих мутантов не полностью поняты.

Мы ранее характеризовали механизмы, с помощью которых сверхэкспрессия SHP2 способствует клеточной адгезии, распространению и движению при раке молочной железы [29]. Результаты настоящего исследования показали, что повышение регуляции SHP2 способствовало связыванию между Gab2 и SHP2 в дополнение к пролиферации клеток. Кроме того, клетки MDA-MB231 и MCF-7, трансдуцированные SHP2 D61G, демонстрировали повышенную адгезию / распространение. Кроме того, мутация SHP2 GOF усиливала пролиферацию, о чем свидетельствуют образование колоний и независимые от фиксации колонии анализы колоний. Эти наблюдения показывают, что гетерозиготные мутации GOF в SHP2, которые были идентифицированы при заболеваниях человека, в достаточной степени повышают клеточный рост доминирующим образом этими клеточными процессами.

Воздействие мутаций SHP2 GOF на клетки рака молочной железы может происходить по оси сигнализации Gab1-ERK. Предыдущие исследования показали, что усиленная активация ERK и Akt коррелирует с увеличением взаимодействия между мутантным SHP2 (SHP2 D61G) и белком леса Ga1 [23, 24, 27]. Этот вывод был дополнительно подтвержден уменьшением экспрессии Gab1, что привело к ингибированию активации сигнального пути MAPL / PI3K. Возросшее взаимодействие между мутантным SHP2 и Gab1, вероятно, связано с конформационным изменением SHP2, индуцированным мутацией D61G. Мутация D61G нарушает внутримолекулярное связывание между N-концевым доменом Sh3 (N-Sh3) и доменом PTP, что приводит к высокоаффинному связыванию между SHP2 и Gab1, поскольку нет затрат на свободную энергию, связанных с нарушением N- Sh3 / PTP и открытие кармана связывания фосфотирозина N-Sh3 [30-33]. Аналогично, в клетках SHP2 D61G-MB231 EGF-индуцированные эффекты ERK и PI3K / Akt были значительно увеличены. Этот результат поддерживает в целом положительные эффекты каталитической активности SHP2 на сигналы ERK и Akt. Однако основные механизмы еще предстоит выяснить.

Используя модель ксенотрансплантата опухоли молочной железы, мы также продемонстрировали, что мутация SHP2 GOF способствовала росту опухоли и метастазированию у голых мышей. Весы и размеры опухолей были значительно увеличены в мутантных группах SHP2 по сравнению с контрольными группами. Наблюдали также увеличение метастазов в легких, печени и почках. Эти наблюдения показывают, что мутация SHP2 способствует росту опухоли и метастазированию in vivo.

В заключение наши результаты показали, что мутация SHP2 GOF способствует миграции и инвазии опухолей. Этот эффект SHP2 может возникать за счет увеличения взаимодействия между Gab1 и SHP2, тем самым способствуя активации сигнального пути MAPK-PI3K. Эти результаты четко определяют роль мутации SHP2 GOF в росте опухоли молочной железы и дают новые сведения о механизмах промотирования опухолей SHP2 GOF, опосредованных мутантами. Дальнейшие исследования должны быть сосредоточены на идентификации терапевтической цели в сигнальных путях Gab1-ERK для ингибирования развития рака молочной железы и исследования новых профилактических и лечебных стратегий для этого заболевания.

MDA-MB231 и MCF-7 человеческие клетки рака молочной железы культивировали в минимальной основной среде Dulbecco Eagle (DMEM), дополненной 10% инактивированной энергией эмбриональной бычьей сывороткой (FBS). Клетки MDA-MB231 и MCF-7 трансфицировали пустым вектором pcDNA3.1 или вектором SHP2 D61G-pcDNA3.1, используя реагент Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, US). Через 24 ч среду заменяли свежей DMEM, содержащей 800 мкг / мкл G418. Культуральную среду заменяли три раза в неделю до появления стабильных трансфецированных колоний. Несколько клонов были объединены и расширены в культуре. Все эксперименты повторялись с по меньшей мере двумя независимыми пулами трансфектантов для каждой конструкции. Это исследование было проведено с одобрения институционального наблюдательного совета Медицинского университета Аньхой.

Активность фосфатазы измеряли щелочной фосфатидно-желтой (pNPP) субстратной системой с использованием коммерческого набора ELISA (Sigma-Aldrich, St. Louis, US). Все процедуры выполнялись в соответствии с инструкциями производителя. Измерения ELISA проводили на 96-луночных планшетах из полистирола с использованием пластинчатого считывателя ELISA (Thermo Scientific, Waltham, США) при 405 нм.

Клетки стимулировали 5 нг / мл EGF в течение определенного периода времени. Целебные лизаты получали путем скребков клеток в буфере гипотонического лизиса (Sigma-Aldrich, St. Louis, US) с последующим центрифугированием при 13000 g в течение 15 мин при 4 ° C. Концентрацию белка определяли с помощью анализа BCA.

Комплект для иммунопреципитации сшивки был приобретен у Thermo Pierce. Эксперименты с иммунопреципитацией проводились в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, антитело SHP2 (10 мкг, Cell Signaling Technology, Беверли, США) сначала инкубировали с белковой А / G плюс агарозную смолу (20 мкл), а затем ковалентно сшивали на смоле путем инкубации с 450 мкМ DSS при комнатной температуре в течение 1 часа. Сток, полученный после 24 ч холодного хранения, сначала предварительно удаляли с использованием контрольной агарозной смолы для уменьшения неспецифического связывания белка. Предварительно очищенный эффлюент инкубировали с белками A / G белка, соединенными с анти-SHP2 (Cell Signaling Technology, Беверли, США) при 4 ° C в течение ночи. Эффлюент элюировали из гранул с использованием буфера для элюирования антигена для Вестерн-блот-анализа.

Вестерн-блот-анализ проводили, как описано ранее [34]. Вкратце, 15 мкг образцов белка разделяли электрофорезом на SDS-полиакриламидном геле. Отделенные белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Затем мембраны блокировали в PBST (Invitrogen, Carlsbad, US) при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем мембраны были исследованы в течение ночи при 4 ° С со следующими первичными антителами, направленными против целевых белков: антитело против SHP2 кролика (1: 1000, технология клеточной сигнализации, Беверли, США), антитело против гепатита кролика (1: 500, Abcam, Cambridge, UK), p-ERK (1: 1000, Cell SignCell Signaling Technology, Беверли, США), ERK (1: 1000, технология Cell Cellaling, Беверли, США), p-AKT (1: 1000, Cell Signaling Technology, Beverly, US), AKT (1: 1000, технология Cell Signaling, Беверли, США) и β-актин (1: 5000, Abcam, Cambridge, UK). После трех промывок в PBST мембраны инкубировали со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (GE-healthcare, Waukesha, US). Сигналы были обнаружены с использованием метода хемилюминесценции (GE-healthcare, Waukesha, US). Затем мембраны отгоняли с помощью отгоночного буфера в течение 15 мин при комнатной температуре и иммуноблоттировали антиактиновым антителом. Оцифровку пленки проводили с использованием программного обеспечения ImageJ 1.43 G (NIH, Bethesda, MD, USA).

Раковые клетки собирали после трипсинизации и промывали в бессывороточной DMEM, содержащей 0,2% ингибитора трипсина. Клетки повторно суспендировали в концентрации 1 × 105 клеток / мл в DMEM и к каждой лунке 96-луночных планшета добавляли 100 мкл клеточной суспензии, которую покрывали в течение ночи при 4 o C 10 мг / мл фибронектина (FN) и блокировали 1 мг / мл бычьего сывороточного альбумина. Через 30 мин, 1 ч или 2 ч неадгезивные клетки удаляли промыванием фосфатно-буферизованной сывороткой (PBS), а прикрепленные клетки затем окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым в 20% метаноле. После промывки PBS кристально-фиолетовое пятно элюировали 0,1 М цитратом натрия и оптическую поглощаемость измеряли при 499 нм с использованием считывателя микропланшетов.

Перемещение клеток анализировали с использованием системы Transwell (Costar, NY, US), как описано ранее [45]. В этом исследовании использовались трансдукционные камеры с поликарбонатными фильтрами с пористостью 8 мкм (BD Biosciences). В анализе инвазии камеры предварительно покрывали 100 мкл 5 мг / мл Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, США) и загружали в 24-луночные культуральные планшеты. В процессе миграции камеры загружали в 24-луночные культуральные планшеты без предварительного покрытия Matrigel. Вставка для трансвеллера состояла из верхних и нижних камер, разделенных мембраной с размером пор 8 мкм. Клетки MDA-MB231 (1 × 105) трипсинизировали и помещали в верхнюю камеру с DMEM, содержащей 2% FBS. Нижнюю камеру заполняли средой, содержащей 15% FBS. Затем камеры инкубировали при 37 ° С с 5% СО2 в течение 12 ч. Мембрану фиксировали метанолом, и клетки, оставшиеся в верхней камере, удаляли. Мигрированные клетки окрашивали Giemsa и подсчитывали. Для каждой лунки подсчитывалось пять случайных микроскопических полей. Данные были получены из трех лунок для анализа.

Анкорированный независимый рост, который является характерным для тумурогенности in vitro, оценивали с использованием клоногенных анализов с мягким агаром. Клетки отделяли и помещали в 0,6% агарозу (1 × 103 клеток / лунку в 6-луночные планшеты) с 1,2% агарозной подложкой. Число колоний подсчитывалось через 18 дней. Для анализа образования фокуса клетки повторно и культивировали в течение 4 недель в DMEM с 10% FBS. Затем клетки фиксировали формалином и окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым.

Чтобы исследовать влияние ангиогенеза опухоли, мы использовали трехмерную (3D) модель. Восемь-камерные слайды предварительно покрывали 150 мкл Matrigel. В общей сложности 2,5 × 103 мутантных или контрольных клеток MCF-7 повторно суспендировали в среде DMEM и затем высевали поверх покрытых камерных слайдов. Клетки культивировали в течение 30 мин, а затем среду заменяли 150 мкл 5% Matrigel. Через 15 мин инкубации добавляли 500 мкл DMEM. Верхний слой среды менялся каждые четыре дня.

Опухолевые клетки (2 × 106) разбавляли PBS до общего объема 0,1 мл и вводили в середину дорса мышей BALB / c (4-6 недель). Животных проверяли еженедельно для развития опухоли. Растущие опухоли измеряли с помощью вертушечных суппортов, а объемы опухолей рассчитывали с использованием формулы объем = длина × ширина2 × 10. На основании данных объема опухоли мышей умерщвляли, а опухоли выделяли через 50 дней после инъекции. При удалении опухоли объемы опухоли рассчитывали с использованием уравнения объема опухоли = (длина × ширина2) / 2. Образцы опухолей фиксировали в 10% нейтральном буферном формалине для дальнейшего анализа.

Иммуногистохимические процедуры выполнялись, как описано ранее [46]. Образцы опухолей фиксировали в 10% нейтральном буферном формалине в течение по меньшей мере 24 часов. Выполнение парафина выполняли, и разрезы (3 мкм) разрезали и окрашивали гематоксилином и эозином (H & E).

Все эксперименты повторялись минимум 3 раза. Данные показаны как среднее значение ± стандартное отклонение. Группы сравнивались с использованием однонаправленного ANOVA, за которым следовал анализ коэффициента Pearson по двумерной корреляции. Значение p ниже 0,05 считалось значительным.

Никто

РАСКРЫТИЕ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ КОНФЛИКТОВ ИНТЕРЕСОВ

У авторов нет конфликта интересов, чтобы заявить.

ПОДДЕРЖКА ГРАНТА

Эта работа была поддержана грантом Национального фонда естественных наук Китая (коды: 30873046, 30973424, 81501444 и 81072663).

rupubmed.com

Белок с низкой молекулярной массой тирозин-фосфатаза позволяет прогнозировать исход рака предстательной железы, увеличивая его метастатический потенциал

Актуальность

Пациенты, страдающие раком предстательной железы (РПЖ) низкой степени онкологического риска, в настоящее время направляются на активное наблюдение, а не подвергаются радикальной простатэктомии. Однако, недоступны чёткие параметры для отбора пациентов для той или иной стратегии, в связи с чем нужны новые биомаркеры и модальности лечения. Низкомолекулярный белок тирозин-фосфатаза (НМБТФ) может представлять собой такой маркер.

Цель исследования

Оценить корреляцию между уровнями НМБТФ в первичном РПЖ с клиническим исходом и определить роль НМБТФ в клеточной биологии опухолей простаты.

Дизайн, условия и участники исследования

Экспрессия растворимой кислой фосфатазы – 1 (ACP1) оценивалась с помощью данных микрочипового анализа, которые в дальнейшем были использованы для анализа биохимических каскадов Ingenuity. На тканевом материале 481 пациента с РПЖ, для которых были сохранены клинические и морфологические данные, проводилось иммуногистохимическое исследование. Модели клеточных линий РПЖ были использованы для изучения роли НМБТФ в пролиферации, миграции, адгезии и резистентности к аноикису клеток.

Определение результатов и статистический анализ

Взаимосвязь между экспрессией НМБТФ и клиническими и морфологическими результатами была определена с помощью корреляции хи-квадрат и мультивариабельного анализа регрессии Кокса. Функциональные последствия гиперэкспрессии НМБТФ или down-регуляции были определены с помощью тест-систем на миграцию и адгезию, конфокальной микроскопии, Вестерн-блоттинга и анализа пролиферации.

Результаты и ограничения

Экспрессия НМБТФ была значительно повышенной в клетках РПЖ человека и коррелировала с ранним рецидивом заболевания (отношение рисков [ОР]: 1.99; p < 0.001) и снижением выживаемости пациентов (ОР: 1.53; p = 0.04). Чистый анализ Ingenuity, сравнивающий рак и нормальную ткань простаты, предполагает склонность РПЖ к миграции. Действительно, гиперэкспрессия НМБТФ повышает способность клеток к миграции, резистентность к аноикису, и снижает активацию киназы / паксиллина при фокальной адгезии, что соответствует снижению общей адгезивной способности.

Заключение

Гиперэкспрессия НМБТФ при РПЖ характеризует злокачественный фенотип с плохим клиническим исходом. Проспективное наблюдение должно определить клинический потенциал для определения гиперэкспрессии НМБТФ.

Ключевые слова: биомаркер, метастазы, фосфатазы, рак простаты.

Low-Molecular-Weight Protein Tyrosine Phosphatase Predicts Prostate Cancer Outcome by Increasing the Metastatic Potential

By: Roberta R. Ruela-de-Sousa, Elmer Hoekstra, A. Marije Hoogland, Karla C. Souza Queiroz, Maikel P. Peppelenbosch, Andrew P. Stubbs, Karin Pelizzaro-Rocha, Geert J.L.H. van Leenders, Guido Jenster, Hiroshi Aoyama, Carmen V. Ferreira and Gwenny M. Fuhler

  • a Department of Gastroenterology and Hepatology, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands
  • b Department of Biochemistry and Tissue Biology, University of Campinas, Campinas, Brazil
  • c Department of Pathology, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands
  • d Center for Experimental and Molecular Medicine, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands
  • e Department of Bioinformatics, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands
  • f Department of Urology, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands

European Urology, Volume 69 Issue 4, April 2016, Pages 710-719

Keywords: Biomarker, Metastasis, Phosphatases, Prostate cancer

Автор перевода: Шатылко Тарас Валерьевич

Тематики и теги

www.uroweb.ru

Антитела к GAD/IA-2 (антитела к глютаматдекарбоксилазе и тирозинфосфатазе суммарные, GAD/IA-2 Antibody)

Метод определения Иммуноферментный анализ.

Исследуемый материал Сыворотка крови

Доступен выезд на дом

Антигенами антител к островковым клеткам является обширная группа мембранно-ассоциированных и цитоплазматических белков островковых клеток, причем ряд антигенов является общим для эндокринной и нервной ткани. Среди семейства антител к островковым клеткам хорошо изучены несколько основных антигенов, таких как глютаматдекарбоксилаза (GAD), эндогенный инсулин, тирозин-фосфатаза (IA-2) и около 20 минорных антигенов. Фермент глютаматдекарбоксилаза (ГДК, GAD) массой 65 кДа является основной мишенью аутоантител у больных сахарным диабетом 1-го типа и латентным аутоиммунным диабетом взрослых (LADA), кроме того, аутоантитела против GAD часто выявляют при диабете беременных.

Антитела к тирозинфосфатазе (IA-2) являются маркером сахарного диабета 1-го типа, их присутствие выявляют у 50-70% пациентов (детей и подростков) в дебюте заболевания. Как и частота выявления других серологических маркеров сахарного диабета, их встречаемость падает после дебюта заболевания. Антитела к тирозинфосфатазе встречаются преимущественно у детей старше 10 лет и подростков, в то время как антитела к инсулину выявляют исключительно у детей моложе 10 лет. В связи с этим совместное выявление антител к GAD и антител к эндогенному инсулину рекомендуют при обследовании детей 5-10 летнего возраста с подозрением на сахарный диабет, в то время как для пациентов в возрасте старше 10 лет рекомендуется сочетать выявление антител к GAD и антител к IA-2. 

При прогнозировании заболевания у близких родственников больных сахарным диабетом вероятность заболевания значительно увеличивается, если выявлено несколько серологических маркеров в крови обследуемого. Так, совместное выявление трех или четырех диабет-специфических аутоантител повышает риск заболевания до 85-90%.

Литература

  1. Лапин С.В., Тотолян А.А. Иммунологическая лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний. Издательство «Человек», СПб — 2010.
  2. Tietz Clinical guide to laboratory tests. 4-th ed. Ed. Wu A.N.B.- USA,W.B Sounders Company, 2006,1798 p.
  3. Conrad K., Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantibodies in Organ Specific Autoimmune Diseases: A Diagnostic Reference/ PABST, Dresden – 2011.
  4. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantibodies in Systemic Autoimmune Diseases: A Diagnostic Reference/ PABST, Dresden – 2007.
  5. Gershvin M.E., Meroni P.L., Shoenfeld Y. Autoantibodies 2nd ed./Elsevier Science – 2006.
  6. Shoenfeld Y., Cervera R., Gershvin M.E. Diagnostic Criteria in Autoimmune Diseases / Humana Press – 2008.
  7. Материалы фирм-производителей наборов реагентов.

www.invitro.ru

Антитела к тирозин-фосфатазе (анти-IA2) — сдать анализ в г. Казань: цена, расшифровка

Стоимость услуги: Казань, Альметьевск, Бугульма, Волжск, Зеленодольск, Йошкар-Ола, Набережные Челны, Новочебоксарск, Лениногорск, Ижевск, Елабуга

Взятие биоматериала оплачивается дополнительно

Взятие крови из периферической вены : 120.00 р.

Биоматериал: Сыворотка крови

Срок выполнения (в лаборатории): 11 р.д.*

Описание

Антитела к тирозинфосфатазе (IA-2) вырабатываются к тирозинфосфатазе β-клеток поджелудочной железы, которые участвуют в синтезе инсулина. Данный анализ позволяет определить природу сахарного диабета (инсулинозависимый или нет) и назначить эффективную фармакотерапевтическую поддержку на основании полученных результатов. 

Антитела к тирозинфосфатазе (IA-2) вырабатываются к тирозинфосфатазе β-клеток поджелудочной железы, которые участвуют в синтезе инсулина. Данный анали

Показания к назначению

Диагностика аутоиммунных заболеваний поджелудочной железы.

Подготовка к исследованию

Взятие крови проводится натощак или не ранее, чем через 4 часа после последнего приема пищи.

Интерпретация результатов/Информация для специалистов

Повышение референсных значений: подозрение на аутоиммунные заболевания поджелудочной железы.
Понижение референсных значений: норма.

На результат влияют патологии иммунной системы, аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания урогенитального тракта.

Правила взятия:

После взятия крови пробирку 8-10 раз плавно переворачивают для тщательного перемешивания крови с активатором формирования сгустка. 

С этой услугой чаще всего заказывают

* На сайте указан максимально возможный срок выполнения исследования. Он отражает время выполнения исследования в лаборатории и не включает время на доставку биоматериала до лаборатории.
Приведенная информация носит справочный характер и не является публичной офертой. Для получения актуальной информации обратитесь в медицинский центр Исполнителя или call-центр.

citilab.ru

Антитела, которые связывают человеческий белок бета-тирозин фосфатазу (нртрвета), и их использование

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к антителам и их антиген-связывающим фрагментам, которые связываются с человеческим белком бета-тирозин фосфатазой (HPTPbeta), и их использованию.

Уровень техники

Ангиогенез, отрастание новых кровеносных сосудов от существующей сосудистой сети, играет важную роль в широком диапазоне физиологических и патологических процессов (Nguyen, L.L. et al., Int. Rev. Cytol., 1-48, (2001)). Ангиогенез представляет собой комплексный процесс, опосредуемый взаимосвязью эндотелиальных клеток, которые выстраивают кровеносные сосуды, с окружающей их средой. На ранних стадиях ангиогенеза клетки ткани или опухолевые клетки продуцируют и секретируют факторы проангиогенного роста в ответ на стимулы окружающей среды, такие как гипоксию. Эти факторы диффундируют к близкорасположенным эндотелиальным клеткам и стимулируют рецепторы, которые ведут к выработке протеаз, которые разрушают окружающий внеклеточный матрикс. Активированные эндотелиальные клетки начинают мигрировать и пролиферировать в окружающую ткань в направлении источника этих факторов роста (Bussolino, F., Trends Biochem. Sci., 22, 251-256, (1997)). Затем эндотелиальные клетки прекращают пролиферировать и дифференцируются в трубчатые структуры, что является первым этапом в формировании стабильных, зрелых кровеносных сосудов. В дальнейшем, периэндотелиальные клетки, такие как перициты и гладкомускульные клетки, становятся материалом для новых образующихся сосудов на следующем этапе формирования зрелых сосудов.

Ангиогенез регулируется балансом природных про- и антиангиогенных факторов. Фактор роста эндотелия сосудов, фактор роста фибробластов и ангиопоэтин представляют собой некоторые факторы из многочисленных потенциальных проангиогенных факторов роста. Эти лиганды связываются с их соответствующими рецепторными тирозин киназами на поверхности эндотелиальных клеток и трансдуцируют сигналы, которые способствуют миграции и пролиферации клеток. Хотя многие регуляторные факторы уже идентифицированы, молекулярные механизмы, которые ведут этот процесс, все еще не поняты полностью.

Существует много болезненных состояний, к которым приводит устойчивый нерегулируемый или неправильно регулируемый ангиогенез. При таких болезненных состояниях нерегулируемый или неправильно регулируемый ангиогенез может вызывать либо конкретную болезнь, либо обострить существующее патологическое состояние. Например, глазная неоваскуляризация вовлечена в наиболее частые случаи слепоты и лежит в основе патологии примерно двадцати глазных заболеваний. При некоторых предварительно существующих состояниях, таких как артрит, вновь образующиеся капиллярные кровеносные сосуды внедряются в суставы и разрушают хрящи. При диабете новые капилляры, образовавшиеся в сетчатке, проникают в тканевую жидкость стекловидного тела, вызывая кровотечение и слепоту.

Как рост, так и метастазирование твердых опухолей также могут быть зависимыми от ангиогенеза, Folkman et al., «Tumor Angiogenesis», Chapter 10, 206-32, in the Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn et al., eds., W. B. Saunders, (1995). Показано, что опухоли, имеющие размер более 2 мм в диаметре, должны получать свое собственное кровоснабжение, и получают его путем индуцирования роста новых капиллярных кровеносных сосудов. После этого новые кровеносные сосуды внедряются в опухоль, обеспечивая питание и факторы роста, специфические для роста опухоли, а также средства для введения опухолевых клеток в циркуляцию и метастазирования в отдаленные места, такие как печень, легкое или кость (Weidner, New Eng. J. Med., 324, 1, 1-8 (1991)). Природные ингибиторы ангиогенеза, когда они используются в качестве лекарства для имеющих опухоли животных, могут предотвращать рост небольших опухолей (O’Reilly et al., Cell, 79, 315-28 (1994)). Согласно некоторым протоколам, применение таких ингибиторов ведет к регрессии опухоли и латентности даже после прекращения лечения (O’Reilly et al., Cell, 88, 277-85 (1997)). Более того, применение ингибиторов ангиогенеза к некоторым опухолям может усиливать их ответ на другие терапевтические режимы (см., к примеру, Teischer et al., Int. J. Cancer, 57, 920-25 (1994)).

Хотя многие болезненные состояния управляются устойчивым нерегулируемым или неправильно регулируемым ангиогенезом, некоторые болезненные состояния можно лечить посредством увеличения ангиогенеза. Рост и восстановление тканей являются биологическими событиями, при которых происходят клеточная пролиферация и ангиогенез. Например, важным аспектом заживления ран является реваскуляризация поврежденной ткани посредством ангиогенеза.

Хронические, незаживающие раны являются главной причиной продолжительных болезней в популяции пожилых людей. Это особенно относится к лежачим пациентам или диабетикам, у которых развиваются тяжелые незаживающие раки кожи. Во многих таких случаях задержка в лечении является результатом неадекватного кровоснабжения либо как результата продолжительного давления, либо из-за закупорки сосудов. Слабая капиллярная циркуляция вследствие небольшого артериального атеросклероза или венозного застоя способствует неудаче в восстановлении поврежденной ткани. Такие ткани часто инфицируются микроорганизмами, которые неудержимо размножаются с помощью врожденных защитных систем тела, которым требуется хорошо васкуляризованная ткань для эффективного уничтожения патогенных организмов. Как результат, в большинстве центров терапевтического вмешательства для восстановления кровотока в ишемических тканях разрешается допуск питательных веществ и иммуно-логических факторов в места ран.

Атеросклеротические изменения в крупных сосудах могут вызывать ишемию тканей, которую можно было бы уменьшить модуляцией роста кровеносных сосудов к измененной ткани. Например, атеросклеротические изменения в коронарных артериях могут вызывать стенокардию и инфаркт миокарда, которые можно было бы предотвратить, если восстановить кровоток посредством стимуляции роста коллатеральных артерий. Аналогично, атеросклеротические изменения в больших артериях, которые снабжают кровью ноги, могут вызывать ишемию в скелетных мышцах, что ограничивает подвижность и в некоторых случаях вызывает необходимость ампутации, которую также можно предотвратить улучшением кровотока с помощью ангиогенной терапии.

Другие болезни, такие как диабет и гипертония, характеризуются уменьшением количества и плотности небольших кровеносных сосудов, таких как артериолы и капилляры. Эти небольшие кровеносные сосуды играют важную роль в доставке кислорода и питательных веществ. Уменьшение количества и плотности этих сосудов способствует неблагоприятным последствиям гипертонии и диабета, включая хромоту, ишемические язвы, повышенное давление и почечную недостаточность. Эти обычные нарушения и многие другие, менее обычные недомогания, такие как болезнь Бюргера, могли бы быть уменьшены посредством увеличения количества и плотности небольших кровеносных сосудов с помощью ангиогенной терапии.

Таким образом, имеется постоянная необходимость в идентификации регуляторов ангиогенеза.

В свете отмеченного выше, имеется необходимость идентифицировать биохимические мишени при лечении связанных с ангиогенезом нарушений. Однако ангиогенез включает действие множества факторов роста и родственных им рецепторных тирозин киназ (RTKs) (Yancopoulos et al., Nature, 407, 242-248, 2000). Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), например, важен для дифференциации эндотелиальных клеток в возникающие кровеносные сосуды в сосудистой сети зародыша. Кроме того, VEGF усиливает развитие сосудов в зрелую сосудистую сеть. Введение экзогенного VEGF усиливает развитие коллатеральной сосудистой сети и улучшает кровоток к ишемическим тканям.

На сегодняшний день идентифицировано три VEGF RTKs, VEGFR1 (FLT-1), VEGFR2 (KDR) и VEGF3 (FLT-4). Несмотря на то, что эти три рецептора являются высоко консервативными, что основывается на биохимических характеристиках и биологической активности, каждый имеет специфические и не перекрывающиеся функции. Считается, что из этих трех рецепторов VEGFR2 играет преобладающую роль в опосредовании VEGF-влияния при развитии сосудистой системы и во время ангиогенеза у взрослых. Однако для нормального развития сосудистой системы зародыша требуются также и VEGFR1, и VEGFR3, и, возможно, они имеют важное значение для ангиогенеза в зрелых тканях. После VEGF-связывания и димеризации конформационное изменение в VEGFR2-киназном домене усиливает свою киназную активность, приводя к «ауто-фосфорилированию» другого члена пары на специфических тирозиновых остатках. Эти события аутофосфорилирования служат дальнейшему увеличению киназной активности и обеспечивают якорные точки для соединения интрацеллюлярных сигнальных молекул.

Тем не менее, активация единственного ангиогенного пути может быть недостаточной, чтобы производить устойчивые и функциональные сосуды, которые обеспечивали бы адекватную перфузию к ишемическим тканям. Эти факты, наряду с тем, что многочисленные RTKs вовлечены в сборку сосудистой системы зародыша, указывают, что биохимические мишени, которые модулируют многочисленные ангиогенные пути, будут иметь преимущества над введением единственного фактора роста.

Белковые тирозин фосфатазы (PTPs) содержат большое семейство близкородственных ферментов, которые дефосфорилируют белки, содержащие фосфотирозиновые остатки. Недавние данные позволяют предположить, что одна из функций PTPs заключается в ограничении фосфорилирования и активации RTKs. Например, было показано, что НСРТРА, белковая тирозин фосфатаза с низким молекулярным весом, связывается с VEGFR2 и негативно регулирует его активацию в культивируемых эндотелиальных клетках и его биологическую активность в анализах ангиогенеза (Huang et al., Journal of Biological Chemistry, 274, 38183-38185, 1999).

Помимо VEGFR2, сигнализирующего вход от другой RTK, рецептор Tie-2 также является важным для ангиогенеза (Ang1 и Ang2). Делеция Ang1- либо Tie-2-гена у мыши может привести к летальности зародыша, вторичной ненормальности в развитии сосудистой системы (Yancopoulos et al., Nature, 407, 242-248, 2000). Кроме того, сверхэкспрессия Ang1 в коже увеличивает сосудистость кожи, а введение экзогенного Ang1 увеличивает кровоток к ишемической скелетной мышце (Sun et al., J. Clin. Invest., Science, 282, 468-471, 1998). Более того, ингибирование активации Tie-2 подавляет ангио-генез и ограничивает прогрессирование опухоли на животных моделях рака (Lin et al., J. Clin. Invest., 100, 2072-2078, 1997). Помимо своих ангиогенных активностей активация Tie-2 экзогенным введением Ang1 блокирует опосредуемое VEGF рассеивание сосудов и провоспалительные эффекты, но увеличивает его ангиогенные эффекты (Thurston et al., Nature Medicine, 6, 460-463, 2000). Поэтому биологические мишени, которые модулируют как VEGFR2, так и Tie-2, могут дать превосходную проангиогенную или антиангиогенную терапию.

HPTPbeta (впервые описанную у Kruegar et al., EMBO J., 9 (1990)) предложено использовать для модулирования активности ангиобелка рецепторного типа тирозин киназы Tie-2 (к примеру, WO 00/65088). HPTPbeta также предлагается использовать для регулирования активностей VEGFR2, к примеру, опубликованная заявка на патент США №2004/0077065.

Было бы желательным получить антитела, к примеру, гуманизированное моноклональное антитело, которое селективно регулирует активность HPTPbeta и тем самым усиливает ангиогенное сигнализирование, стимулирует рост кровеносных сосудов (ангиогенез) и (или) увеличивает кровоток к ткани, на которую оказывается воздействие, или уменьшает ангиогенное сигнализирование, уменьшает рост кровеносных сосудов и (или) уменьшает кровоток к ткани, на которую оказывается воздействие. Здесь описываются антитела и их фрагменты, которые связывают HPTPbeta и регулируют ангиогенное сигнализирование клеток, которое, в свою очередь, регулирует ангиогенез.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к антителам, которые связывают человеческий белок тирозин фосфатазу бета HPTPbeta и тем самым регулируют ангиогенное клеточное сигнализирование, которое, в свою очередь, регулирует ангиогенез.

В одном варианте осуществления изобретение относится к выделенному антителу или его антиген-связывающему фрагменту, который связывается с человеческой тирозин фосфатазой бета, где упомянутое антитело или его антиген-связывающий фрагмент регулирует ангиогенное клеточное сигнализирование, которое, в свою очередь, регулирует ангиогенез.

В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое связывает N-концевую часть человеческого белка тирозин фосфатазы бета.

В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое связывает первый FN3-повтор человеческого белка тирозин фосфатазы бета.

В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое связывает первый FN3-повтор человеческого белка тирозин фосфатазы бета, где первый FN3-повтор человеческого белка тирозин фосфатазы бета имеет последовательность, как показано в SEQ ID:11, или ее части.

В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, где антитело является моноклональным антителом.

В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, где антитело является моноклональным антителом R15E6 (мышиная гибридома, Balbc-клетки селезенки (В-клетки), депонированные в Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 USA 4 мая 2006, под АТСС № РТА-7580).

В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, имеющему те же самые, или практически те же самые, биологические характеристики, что и R15E6.

В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, где антитело или антиген-связывающий фрагмент является гуманизированным.

В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, где антитело содержит антиген-связывающие остатки области из моноклонального антитела R15E6 и является гуманизированным.

В другом варианте осуществления изобретение относится к антиген-связывающему фрагменту антитела, причем этот фрагмент содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей.

В другом варианте осуществления изобретение относится к антиген-связывающему фрагменту антитела, где антиген-связывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fv-фрагмента, Fab-фрагмента, Fab’-фрагмента и F(ab’)2-фрагмента.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения регулируемого ангиогенезом нарушения у субъекта, содержащему этапы, на которых идентифицируют субъекта, нуждающегося в регулировании ангиогенеза, и вводят субъекту эффективное количество антитела или его антиген-связывающего фрагмента, которые связывают HPTPbeta и регулируют ангиогенез.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения регулируемого ангиогенезом нарушения у субъекта, где регулируемое ангиогенезом нарушение является нарушением с повышенным ангиогенезом и выбрано из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, деградации желтого пятна сетчатки глаза, рака, серповидно-клеточной анемии, саркоида, сифилиса, псевдоксантомы эластикум, болезни Педжета, окклюзии вен, окклюзии артерий, обструктивного заболевания сонной артерии, хронического увеита/витрита, микобактериальной инфекции, болезни Лайма, системной волчанки (волчаночный эритематоз), ретинопатии недоношенности, болезни Илза, болезни Бехчета, инфекций, вызванных ретинитом или хориоидитом, предполагаемого глазного гистоплазмоза, болезни Беста, миопии, глазных ямок, болезни Старгардта, pars planitis, хронического отслоения сетчатки, синдрома гипервязкости, токсо-плазмоза, травмы и пост-лазерных осложнений, болезней, связанных с покраснением радужки, и пролиферативной витреоретинопатии.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения регулируемого ангиогенезом нарушения у субъекта, где регулируемое ангиогенезом нарушение является нарушением с повышенным ангиогенезом и выбрано из группы, включающей в себя — но не ограниченной ими — диабетическую ретинопатию, деградацию желтого пятна сетчатки глаза, рак, ревматоидный артрит, гемангиому, болезнь Рандю-Вебера-Ослера, или наследственную геморрагическую телеангиэктазию, и твердые или переносимые кровью опухоли.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения регулируемого ангиогенезом нарушения у субъекта, где регулируемое ангиогенезом нарушение является нарушением с повышенным ангиогенезом и выбрано из группы, состоящей из воспалительных кишечных заболеваний, таких как болезнь Крона и язвенные колиты, псориаза, саркоидоза, ревматоидного артрита, гемангиомы, болезни Рандю-Вебера-Ослера, или наследственной геморрагической телеангиэктазии, твердых или переносимых кровью опухолей и синдрома приобретенного иммунодефицита.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения регулируемого ангиогенезом нарушения у субъекта, где регулируемое ангиогенезом нарушение является нарушением с пониженным ангиогенезом и выбрано из группы, включающей в себя — но не ограниченной ими — ишемию скелетной мышцы или миокарда, паралич, заболевание коронарной артерии, заболевание периферических сосудов, заболевание мозговых сосудов, диабетическую нейропатию и раневые заживления.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения регулируемого ангиогенезом нарушения у субъекта, где регулируемое ангиогенезом нарушение является нарушением с пониженным ангиогенезом и выбрано из группы, состоящей из ишемии скелетной мышцы или миокарда, паралича, заболевания коронарной артерии, заболевания периферических сосудов.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения нарушения с пониженным ангиогенезом у субъекта, где нарушение с пониженным ангиогенезом является заболеванием периферических сосудов.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения нарушения с пониженным ангиогенезом у субъекта, где нарушение с пониженным ангиогенезом является заболеванием коронарной артерии.

В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или его фрагмент, который связывается с человеческим белком тирозин фосфатазой бета, и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или его фрагмент, который связывается с человеческим белком тирозин фосфатазой бета, где антитело является моноклональным антителом R15E6, и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или его фрагмент, который связывается с человеческим белком тирозин фосфатазой бета, где антитело является моноклональным антителом, имеющим те же самые, или практически те же самые биологические характеристики, как и R15E6, и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или его фрагмент, который связывается с человеческим белком тирозин фосфатазой бета, где антитело или антиген-связывающий фрагмент является гуманизированным, и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или его фрагмент, который связывается с человеческим белком тирозин фосфатазой бета, где антитело содержит антиген-связывающую область остатков из моноклонального антитела R15E6 и является гуманизированным, и фармацевтически приемлемый носитель.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Конструкция и получение НРТРβ ECD-белка. (Панель А) Схематическое представление НРТРβ полной длины и НРТРβ внеклеточного домена-6His слитого белка. (Панель В) Серебряное пятно имидазола элюируется с Ni-NTA-колонки, нагруженной супернатантом из HEK293-клеток, трансфецированных вектором, направляющим экспрессию βECD-6His. Обнаружена единственная полоса с высоким молекулярным весом, согласующаяся с внеклеточным доменом-61-tis НРТРβ-белка.

Фиг.2. R15E6 распознает эндогенную НРТРβ в эндотелиальных клетках. (Панель А) Лизаты эндотелиальных клеток осаждают контрольным антителом (Дорожка 1), R15E6 (Дорожка 2) или смесью анти-Tie2 и анти-VEGFR2 антител (Дорожка 3). Иммунопреципитаты растворяют с помощью SDS-PAGE, передают на PVD-мембрану и зондируют посредством western-блота со смесью R15E6, анти-Tie2 и анти-VEGFR2 антител. Единственная главная полоса с высоким молекулярным весом согласующаяся с НРТРβ, видна с R15E6 (Дорожка 2), но не видна для контрольного антитела (Дорожка 1) или смеси анти-Tie2 и анти-VEGFR2 (Дорожка 3). (Панель В) Эндотелиальные клетки подвергают FACS-анализу с помощью R15E6 (белый пик) или контролю без какого-либо первичного антитела (черный пик). Ясный сдвиг по флуоресценции указывает, что R15E6 связывается с НРТРβ на поверхности интактных эндотелиальных клеток.

Фиг.3. R15E6 усиливает Tie2-рецепторную активацию в HUVEC’s. Tie2 активацию измеряют в эндотелиальных клетках человека, как описано в Примере 4. В зависимости от дозы R15E6 усиливает как базальную, так и Ang1-индуцированную Tie2-активацию.

Фиг.4. R15E6 увеличивает HUVEC-выживание. Выживание сыворотки голодающих эндотелиальных клеток человека измеряют как описано в Примере 4. В соответствии с его эффектами по Tie2-активации R15E6 в зависимости от дозы увеличивает выживание как базальных, так и Ang1-индуцированных эндотелиальных клеток (Панель А). Кроме того, R15E6 также в зависимости от дозы увеличивает выживание VEGF- и FGF-опосредованных эндотелиальных клеток (Панели В и С). Контрольное антитело не увеличивает выживание эндотелиальных клеток (Панель D).

Фиг.5. R15E6 увеличивает HUVEC-миграцию. Миграцию человеческих эндотелиальных клеток измеряют как описано в Примере 4. В зависимости от дозы R15E6 усиливает как базальную, так и VEGF-индуцированную миграцию эндотелиальных клеток.

Фиг.6. R15E6 увеличивает капиллярный морфогенез в HUVEC/Bead Sprouting анализах. Капиллярный морфогенез человеческих эндотелиальных клеток измеряют в анализе разрастания с помощью бусинок, как описано в Примере 4. R15E6 усиливает капиллярный морфогенез как базальных, так и VEGF-индуцированных эндотелиальных клеток.

Фиг.7. Western-блот анализ локализует R15E6 связывающий эпитоп на N-концевом FN3-повторе внеклеточного домена НРТРβ. (Панель А) Согласно western-анализу R15E6 связывается со всеми мутантами, имеющими С-концевые усечения, демонстрируя, что связывающий эпитоп расположен на N-концевых 2 FN3-повторах. (Панель В) Анализ химерных белков человек/мышь далее локализует R15E6 связывающий эпитоп на N-концевом FN3-повторе НРТРβ.

Фиг.8. MSD-анализ подтверждает локализацию R15E6 связывающего эпитопа на N-концевом FN3-повторе внеклеточного домена НРТРβ. (Панель А) Согласно MSD-анализу R15E6 связывается со всеми мутантами, имеющими С-концевые усечения, подтверждая, что связывающий эпитоп расположен на N-концевых 2 FN3-повторах. (Панель В) Анализ химерных белков человек/мышь далее подтверждает локализацию R15E6 связывающего эпитопа на N-концевом FN3-повторе НРТРβ.

Фиг.9. MSD-анализ показывает, что моновалентный Fab-фрагмент R15E6 также связывается с N-концевым FN3-повтором НРТРβ. (Панель А) Подбно интактному R15E6 антителу Fab-фрагмент R15E6 связывается со всеми мутантами, имеющими С-концевые усечения, подтверждая, что связывающий эпитоп локализуется на N-концевых 2 FN3-повторах. (Панель В) Анализ химерных белков человек/мышь далее локализует связывающий эпитоп Fab-фрагмента R15E6 на N-концевом FN3-повторе НРТРβ.

Фиг.10. Моновалентный Fab-фрагмент R15E6 не усиливает Tie2-активацию и блокирует Tie2-активацию интактным R15E6.

Фиг.11. Fab-фрагмент R15E6 мощно ингибирует выживание эндотелиальных клеток. (Панель А) По сравнению с контрольным Fab-фрагментом Fab-фрагмент R15E6 мощно ингибирует выживание эндотелиальных клеток. (Панель В) Ингибиторное действие Fab-фрагмента R15E6 нейтрализуют посредством конкуренции с интактным R15E6.

Фиг.12. Fab-фрагмент R15E6 ингибирует опосредуемую VEGF миграцию эндотелиальных клеток.

Описание перечня последовательностей

Каждая из нуклеотидных и белковых последовательностей, приведенных в перечне последовательностей, наряду с соответствующим(-и) номером(-ами) доступа в Genbank или Derwent, где это уместно, и видами, из которых она происходит, показана в Таблице I.

Таблица I
Описание последовательности Номера SEQ ID: нуклеотидные, белковые Виды Соответствующий № доступа в Genbank
Внеклеточный домен HPTPbeta с His- и Gly-тэгом 1,2 Homo Sapiens
Внеклеточный домен HPTPbeta полной длины 3 Homo Sapiens Х54131 NM_002837
1/2 (АА1-730, 8 FN3’s)775 a 4 Homo Sapiens
1/2 (АА1-376, 4 FN3’s)421 aa 5 Homo Sapiens
1/8 (АА1-202, 2 FN3’s)247 aa 6 Homo Sapiens
Мышиная полной длины ECD1632 aa 7 Mus musculus NM_029928
Первый человеческий FN3-Мышиный ½ 8 Химера человек-мышь
Второй человеческий FN3-Мышиный ½ 9 Химера человек-мышь
Первые два человеческие FN3-Мышиный ½ 10 Химера человек-мышь
Человеческий FN3, первый повтор 11 Homo Sapiens

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к антителам, которые связывают HPTPbeta, и их применению.

Для получения рекомбинантных ДНК, олигонуклеотидного синтеза, тканевой культуры и трансформации (к примеру, электропорации, липофекции) могут быть использованы стандартные методики. Ферментативные реакции и методики очистки могут выполняться согласно спецификациям производителей или так, как они обычно выполняются в данной области техники, или как описывается здесь. Методики и процедуры обычно выполняются в соответствии с традиционными методами, известными в данной области и как описано в различных общих и более конкретных руководствах, которые цитируются и обсуждаются в описании настоящего изобретения. Если не приводится конкретных определений, для обозначения описываемых здесь лабораторных процедур и методик аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии используется терминология, известная и общепринятая в данной области техники. Для химического синтеза, химических анализов, приготовления фармацевтический препаратов, рецептур, методов введения и лечения пациентов могут быть использованы стандартные методики.

Следующие термины, если не указано иначе, должны пониматься в следующих значениях:

«Белок» используется здесь взаимозаменяемо с пептидом и полипептидом. HPTPbeta является человеческим белком тирозин фосфатазой, как определено в перечне последовательностей. В некоторых вариантах осуществления используются различные фрагменты HPTPbeta. Гомологи, ортологи, фрагменты, варианты и мутанты HPTPbeta-белка и гена, как описано ниже, считаются входящими в объем термина «HPTPbeta».

Под «фрагментом» понимается часть нуклеотидной или белковой последовательности. Фрагменты могут сохранять биологическую активность нативного белка. Фрагменты нуклеотидной последовательности полезны также как гибридизационные зонды и праймеры или для регуляции экспрессии гена, к примеру, антисмысловой, siPHK или микроРНК. Биологически активную часть можно получить посредством выделения части одной из нуклеотидных последовательностей согласно изобретению, экспрессирования кодируемой части (к примеру, путем рекомбинантной экспрессии in vitro) и оценки активности кодируемого белка.

Специалист в данной области техники признал бы, что гены и белки из разных видов, иных нежели перечисленные в перечне последовательностей, особенно видов позвоночных, могут быть полезными. Такие виды включают в себя — но не ограничиваются

edrid.ru

Антитела, связывающие тирозин фосфатазу бета человека (hptp ), и их использование

Изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело, полученное из гибридомы АТСС №РТА-7580, специфичное к человеческому белку тирозин фосфатазе бета (НРТРβ). Описан Fab вариант указанного антитела, а также варианты способов лечения и фармацевтические композиции, основанные на использовании антител. При связывании антитела с НРТРβ усиливается передача сигнала Tie-2 и таким образом увеличивается ангиогенез, тогда как при связывании Fab антиген-связывающего фрагмента антитела с НРТРβ ингибируется передача сигнала Tie-2, и таким образом уменьшается ангиогенез. Использование изобретения может найти применение в медицине для лечения заболеваний, связанных с нарушением ангиогенеза. 6 н. и 15 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 табл., 5 пр.

 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

1. Выделенное антитело, способное связываться с человеческим белком тирозин фосфатазой бета (НРТРβ), при этом упомянутое антитело произведено гибридомной клеточной линией АТСС №РТА-7580 и при связывании с НРТРβ усиливает передачу сигнала Tie-2 и таким образом увеличивает ангиогенез.

2. Выделенное антитело по п.1, отличающееся тем, что антитело способно связываться с N-концевой частью НРТРβ.

3. Выделенное антитело по п.2, отличающееся тем, что антитело способно связываться с первым FN3-повтором НРТРβ.

4. Выделенное антитело по п.3, отличающееся тем, что первый FN3-повтор НРТРβ включает последовательность, как показано в SEQ ID NO:11, или ее фрагмент.

5. Выделенное антитело по п.1, отличающееся тем, что антитело является моноклональным антителом.

6. Выделенное антитело по п.1, отличающееся тем, что антитело является гуманизированным.

7. Выделенный Fab антиген-связывающий фрагмент антитела, производимого гибридомной клеточной линией АТСС №РТА-7580, способный связываться с человеческим белком тирозин фосфатазой бета (НРТРβ), при этом упомянутый Fab антиген-связывающий фрагмент при связывании с НРТРβ ингибирует передачу сигнала Tie-2 и таким образом уменьшает ангиогенез.

8. Выделенный антиген-связывающий фрагмент по п.7, отличающийся тем, что антиген-связывающий фрагмент способен связываться с N-концевой частью НРТРβ.

9. Выделенный антиген-связывающий фрагмент по п.8, отличающийся тем, что антиген-связывающий фрагмент способен связываться с первым FN3-повтором НРТРβ.

10. Выделенный антиген-связывающий фрагмент по п.9, отличающийся тем, что первый FN3-повтор НРТРβ включает последовательность, как показано в SEQ ID NO:11, или ее фрагмент.

11. Выделенный антиген-связывающий фрагмент по п.7, отличающийся тем, что антитело является моноклональным антителом.

12. Выделенный антиген-связывающий фрагмент по п.7, отличающийся тем, что антиген-связывающий фрагмент является гуманизированным.

13. Способ лечения нарушения, при котором требуется увеличение ангиогенеза, у субъекта, содержащий этапы, на которых:
а) идентифицируют субъект, нуждающийся в увеличении ангиогенеза; и
б) вводят этому субъекту эффективное количество антитела по любому из пп.1-6.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что нарушение выбрано из группы, состоящей из: скелетно-мышечной или миокардиальной ишемии, инсульта, заболевания периферических сосудов и заболевания коронарной артерии.

15. Способ по п.13, отличающийся тем, что нарушение ангиогенеза является заболеванием периферических сосудов.

16. Способ по п.13, отличающийся тем, что нарушение ангиогенеза является заболеванием коронарной артерии.

17. Способ лечения нарушения, при котором требуется уменьшение ангиогенеза, у субъекта, содержащий этапы, на которых:
а) идентифицируют субъект, нуждающийся в уменьшении ангиогенеза; и
б) вводят этому субъекту эффективное количество антиген-связывающего фрагмента по любому из пп.7-12.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что нарушение выбрано из группы, состоящей из: диабетической ретинопатии, деградации желтого пятна сетчатки глаза, рака, серповидно-клеточной анемии, саркоида, сифилиса, псевдоксантомы эластикум, болезни Педжета, окклюзии вен, окклюзии артерий, обструктивного заболевания сонной артерии, хронического увеита/витрита, микобактериальной инфекции, болезни Лайма, системной волчанки, ретинопатии недоношенности, болезни Илза, болезни Бехчета, инфекций, вызванных ретинитом или хориоидитом, предполагаемого глазного гистоплазмоза, болезни Беста, миопии, глазных ямок, болезни Старгардта, pars planitis, хронического отслоения сетчатки, синдрома гипервязкости, токсоплазмоза, травмы и постлазерных осложнений, болезней, связанных с покраснением радужки, и пролиферативной витреоретинопатии.

19. Способ по п.17, отличающийся тем, что нарушение выбрано из группы, состоящей из воспалительных заболеваний кишечника, включающих болезнь Крона и язвенный колит, псориаза, саркоидоза, ревматоидного артрита, гемангиомы, болезни Рандю — Вебера — Ослера или наследственной геморрагической телангиектазии, твердых или переносимых кровью опухолей и синдрома приобретенного вируса иммунодефицита.

20. Фармацевтическая композиция для увеличения ангиогенеза, содержащая:
a) эффективное количество антитела по любому из пп.1-6; и
b) фармацевтически приемлемый носитель.

21. Фармацевтическая композиция для уменьшения ангиогенеза, содержащая:
a) эффективное количество антиген-связывающего фрагмента по любому из пп.7-12; и
b) фармацевтически приемлемый носитель.

findpatent.ru

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *