Определение количества гемоглобина.
Количество гемоглобина можно определить или спектроскопически, посредством определения количества железа, или путем измерения красящей способности крови (колориметрически).
Для клинических целей используется последний метод, который требует небольшого количества крови и дает возможность быстро определить количество гемоглобина. Наиболее распространенным является метод Говерса в видоизменении Сали.
Определение гемоглобина по Сали основано на том, что гемоглобин крови в растворе соляной кислоты переходит в солянокислый гематин, который и сравнивается с гематином определенной концентрации, взятом в качестве стандарта. Процент гемоглобина в этом случае определяется колориметрически.
Набор Сали состоит из запаянной стандартной пробирки, наполненной раствором солянокислого гематина. Ввиду того, что стандартная жидкость довольно быстро выцветает, в последнее время выпущены стандарты из цветного стекла, окрашенные под цвет солянокислого гематина металлическими окислами. Эти стандарты не выцветают даже под действием прямого солнечного света.
Между стандартными пробирками помещается пробирка, имеющая деления от 10 до 140 или от 10 до 170 такого же диаметра, как и первая. Пробирка с делением от 10 до 140 предназначена для определения гемоглобина в единицах Сали, а от 10 до 170—в процентах.
Подставка, в которой помещаются стандартные и градуированные пробирки, представляет собою деревянную колодку с вырезанными продольными отверстиями и углублениями для них. Сзади колодки прикреплено матовое стекло, которое дает рассеянный свет; на его фоне резко оттеняется окраска стандарта и испытуемой сыворотки.
Для взятия крови прилагается капиллярная пипетка с меткой 20 мм, которая определяет количество крови, взятой для исследования.
Кроме гемоглобинометра, для определения гемоглобина необходимо иметь N/10 раствор НС1 и дистиллированную воду.
Техника определения следующая. В градуированную пробирку до метки 20 набирается N/10 раствор НС1, затем в капилляр до метки 20 мм3 насасывается кровь и, осторожно очистив конец капилляра, переносят ее в пробирку
|
Рис. Гемоглобинометр Сали. |
С соляной кислотой. Кровь осторожно выдувают в А710 раствор соляной кислоты, содержимое пробирки из верхнего прозрачного слоя набирается в капилляр и снова выдувается в пробирку.
Капилляр промывается 2 или 3 раза и осторожно удаляется из пробирки. Кровь гемолизируется, и при распаде образуется солянокислый гематин. Жидкость постепенно становится коричневой. Спустя 5—7 минут после выдувания крови, в пробирку начинают прибавлять дистиллированную воду. Вначале прибавляют по нескольку капель, а затем, по мере изменения цвета и приближения его к стандарту,—то одной капле. Кровь смешивается или стеклянной палочкой с утолщением на конце или же покачиванием прсбирочки. Необходимо следить за тем, чтобы жидкость при смешивании не терялась.
Уровень жидкости после разведения указывает на количество гемоглобина. Учет ведется по нижнему мениску жидкости. Допустимой ошибкой при вторичном исследовании той же самой крови считается расхождение в пределах пяти делений. Метка 80 на пробирке с делением до 140 и цифра 100 на пробирке с делением до 170 соответствует 16,0—17,0 гемоглобина в 100 мл крови. Чтобы получить абсолютную цифру, показывающую количество гемоглобина в граммах в 100 мл крови, необходимо показания гемометра в процентах Сали умножить на 0,17, а количество в единицах— на коэффициент 0,2125.
|
Вид животного |
Средний показатель в % Сали |
Колебания |
В 100 мл крови в г |
Фамилия автора |
|
Крупный рогатый скот…. Овцы Козы Буйволы Яки Верблюды Лошади Свиньи Собаки Кошки Кролики Куры Гуси |
65 68 63 49 57 90 80 67 80 65 69 75 95 |
56—74 54—80 45—81 28—70 36—78 66—114 50—110 55—79 65—95 47—83 51—87 51—99 80—110 |
11,0 11,6 10,7 8,3 9,6 15,2 13,6 10,2 13,6 11,0 11,7 12,7 16,1 |
Д. Соколов Л. Лебедев B. Чагин К. Мавсун-Заде П. Карасев Н. Семушкин C. Хрусталев A. Васильев B. Зайцев C. Веремейчик |
Количество гемоглобина у здоровых животных колеблется в следующие пределах (см. табл. на стр. 418).
Колебания гемоглобина зависят от возраста, пола, породы, характера кормления и некоторых других условий. При патологических процессах количество гемоглобина может быть увеличено и уменьшено по сравнению с нормальными показателями.
Увеличение количества гемоглобина носит название плейохромии. Она может возникнуть вследствие сгущения крови при потере жидкости организмом (понос, рвота, потливость), при образовании экссудатов и транссудатов, Плейохромию отмечают при кровепятнистой болезни лошадей, интоксикациях и отравлениях. Повышение количества гемоглобина отмечается при физическом напряжении лошади. При хорошей подготовке (тренировка) количество гемоглобина остается почти без изменений.
Уменьшение гемоглобина (олигохромемия) встречается довольно часто и особенно при заболеваниях, связанных с анемией. Олигохромемия является симптомом острых и хронических заболеваний, различных по своему происхождению.
Олигохромемия связана с уменьшением общего количества эритроцитов или обеднением эритроцитов гемоглобином. Следовательно, олигохромемия определяет не только степень, но и характер анемии. Необходимо, однако, учесть, что правильная оценка может быть сделана только при условии подсчета эритроцитов и определения величины цветного показателя.
Определение цветного показателя. Цветной показатель дает представление об отношении гемоглобина к красным кровяным тельцам. Метод определения цветного показателя основан на сравнении. Если в норме цветной показатель равен примерно единице, то изменение этой цифры в сторону увеличения или уменьшения рассматривается, как весьма важный показатель нарушения соотношения между эритроцитами и гемоглобином.
У животных определение цветного показателя проводится по формуле:
Гемоглобин 2 Эритроциты 2 Гемоглобин 2 х эритроциты 1
Гемоглобин 1 / эритроциты 1 = гемоглобин 1 x эритроциты 2
Где гемоглобин 1 и эритроциты 1 показывают среднее количество гемоглобина и эритроцитов у здорового животного и гемоглобин 2 и эритроциты 2—найденное количество гемоглобина и эритроцитов у исследуемых животных. Если у лошади взять за норму количество гемоглобина 75, а эритроцитов 7 500 000, то цветной показатель будет равен единице. Всякое отклонение в количестве гемоглобина и эритроцитов поведет к изменению цветного показателя. Необходимо учитывать только такие отклонения от нормы, которые превышают 15%. Небольшие отклонения учитывать не следует.
Определение цветного показателя имеет значение в дифференциации анемий. При постгеморрагических анемиях, когда имеется одновременно уменьшение как количества эритроцитов, так и гемоглобина, цветной показатель приближается к единице; ниже единицы цветной показатель бывает при вторичных анемиях, при которых снижается количество гемоглобина, при почти нормальном или слегка сниженном количестве эритроцитов; выше единицы цветной показатель отмечается при гемолитических анемиях, когда в ток крови выбрасывается значительное количество молодых клеток (повышенная регенерация).
Для суждения о средней насыщенности эритроцитов гемоглобином практически можно использовать определение кровяного числа. Оно получается делением найденного количества гемоглобина на число эритроцитов в миллионах, например:
75% / 7(000000) = 11 или 90% / 10(000000) =9
Величина кровяного числа неодинакова у различных животных и зависит от количества эритроцитов и гемоглобина в норме, но в среднем она приближается к 10.
Методы определения количества гемоглобина в крови — Физиология
Определение количества гемоглобина в крови по методу Сали
Гемоглобин (Hb) основной дыхательный пигмент эритроцитов, относящийся к хромопротеидам и обеспечивающий ткани кислородом, состоит из белка глобина и гема соединения протопорфирина IX с железом. Последний придает гемоглобину характерную окраску. Присоединение к гему различных химических групп сопровождается изменением окраски. На этом основано определение концентрации гемоглобина крови.Для определения содержания Hb в крови предложено много различных методов. Наибольшее распространение получили колориметрические методы, основанные на колориметрии производных гемоглобина.
В настоящее время принят унифицированный гемиглобинцианидный метод определения количества гемоглобина. Гемоглобин окисляют в метгемоглобин (гемиглобин) железосинеродистым калием; образующийся с ацетонциангидрином окрашенный цианметгемоглобин (гемиглобинцианид) определяют колориметрически с помощью фотоэлектроколориметра, счетчика и гематологического автомата.
Наиболее распространенным в прошлом было определение количества гемоглобина по методу Сали. Этот метод чрезвычайно прост и быстро выполним, но недостаточно точен. Он основан на колориметрии солянокислого гематина. При смешивании крови с соляной кислотой Hb превращается в солянокислый гематин, имеющий коричневый цвет. Полученную смесь разбавляют дистиллированной водой до цвета раствора в стандартных пробирках, находящихся в крайних гнездах гемометра. Этот раствор имеет интенсивность окраски, соответствующую содержанию гемоглобина, равному 166,7 г/л.В норме в крови содержится около 140 г/л гемоглобина (у женщин 120-140 г/л, у мужчин 130-160 г/л, у новорожденных 217 г/л).
Проведение работы
1. В градуированную пробирку гемометра наливают до первой метки 0,1N раствор соляной кислоты.
2. Капиллярной пипеткой набирают кровь точно до метки 20 мм и осторожно выдувают ее на дно пробирки. Не вынимая пипетки из пробирки, промывают ее соляной кислотой, встряхивая пробирку, тщательно перемешивают ее содержимое. Для завершения реакции смеси дают постоять не менее пяти минут.
3. Специальной пипеткой прибавляют к смеси по каплям дистиллированную воду, перемешивая содержимое палочкой. Это продолжается до тех пор, пока цвет исследуемой жидкости не сравняется с окраской стандартного раствора.
4. Отмечают по шкале, на каком делении стоит уровень верхнего края мениска, полученного раствора солянокислого гематина. Если по шкале пробирки единица измерения Hb r%, то чтобы выразить результат в СИ, умножают найденную цифру на 10.Например, Hb = 13,2 г%*10 = 132 г/л,Источниками ошибок могут быть: выцветшие стандартные растворы в старых гемометрах; неточное соблюдение пятиминутной выдержки перед началом разведения; попадание воздуха в капилляр с кровью
ifreestore.net
2) Определение количества гемоглобина в крови по способу Сали (Учебное пособие «Физиология крови», стр.23)
Ход работы: с помощью пипетки налить в среднюю пробирку гемометра Сали 0,1 % раствор хлористоводородной кислоты до нижней метки. Протереть спиртом и проколоть кожу мякоти пальца. С помощью микропипетки и резиновой груши набрать 20 мкл крови. Обтереть кончик капилляра и, погрузив его в 0,1% раствор хлористоводородной кислоты на дно пробирки гемометра, осторожно, чтобы не образовалась пена, выдуть кровь и дважды сполоснуть капилляр раствором. Оставить гемометр на 4-5 минут. За это время кислота, разрушив оболочку эритроцитов, превратит гемоглобин в хлорид гематина, который имеет характерный коричневый цвет. В среднюю пробирку прибавлять по каплям дистиллированную воду до тех пор, пока цвет раствора в ней не станет таким, как в стандартных пробирках. Это и будет величина, которая арактеризует количество гемоглобина в крови в абсолютных или тносительных единицах (в зависимости от типа шкалы гемометра).
3) Расчет цветового показателя крови (Учебное пособие «Физиология крови», стр.24)
Величина этого показателя воссоздает относительное содержание гемоглобина в эритроцитах. При нормальном насыщении эритроцитов гемоглобином цветовой показатель находится в границах 0,86-1,05. Увеличение или уменьшение его свидетельствует о нарушении насыщения эритроцитов гемоглобином. Для расчета цветового показателя крови пользуются формулой:
ЦП = (количество Нв (г/л) * 3)/первые три цифры числа эритроцитов (в 1 мкл)
4) Лейкоцитарная формула (Учебное пособие «Физиология крови», стр.59-60)
5) Определение времени продолжительности кровотечения и скорости свертывания (Учебное пособие «Физиология крови», стр.49)
Время
Ход работы. Стерильным скарификатором делается прокол пальца и сразу же начинают отсчет времени. Выступающую каплю крови каждые 30 сек осторожно впитывают фильтровальной бумагой, не прикасаясь к раневой поверхности. Момент, когда на фильтровальной бумаге больше не появляется кровяное пятно, отмечают как окончание кровотечения.
В норме при определении времени кровотечения этим способом кровотечение останавливается через 2-3 мин.
Определение скорости свертывания крови по Сухареву.
Ход работы: Кровь для анализа берут из пальца руки человека. Набирают в капилляр столбик крови высотой 25 — 30 мм. Отмечают по секундомеру время. Наклоном капилляра переводят кровь на середину трубки. Держа капилляр двумя пальцами, покачивают его на 30 — 45^ в обе стороны. Свободное смещение крови показывает, что свертывание еще не наступило.
Начало свертывания характеризуется замедлением движением крови при наклоне капилляра: на его внутренней стенке появляются небольшие сгустки.
Полное свертывание крови соответствует моменту полной остановки движения крови. В выводах осветить какие процессы гемостаза отражают данный метод.
6) Определение группы крови (Учебное пособие «Физиология крови», стр.57)
Ход работы: на специальные тарелки наносят (не смешивая!) по капле стандартной сыворотки 1, 2 и 3 групп, содержащей соответственно
агглютинины 1 — альфа и бета; 2 — бета и 3 — альфа. Углом предметного стекла переносят небольшое количество крови, полученной из пальца, в каплю сыворотки 1 группы, затем вторым чистым углом предметного стекла такое же количество крови переносят в сыворотку 2 группы. Третью каплю переносят в сыворотку 3 группы третьим углом предметного стекла. Каждый раз тщательно размешивают кровь в капле сыворотки, пока смесь не станет равномерно розового цвета. Реакция агглютинации наступает через 1 — 5 мин. При наличии агглютинации капля становится прозрачной, а эритроциты склеиваются в виде комочков. Группа крови устанавливается в зависимости от наличия или отсутствия агглютинации. Зарисуйте схематично результаты опыта, а в выводах определите, каким реципиентам может быть перелита исследуемая кровь и какие современные требования к гемотрансфузии крови в зависимости от Фуппы крови донора и реципиента.
studfiles.net
Особенности определения гемоглобина в крови, основные методы диагностики и лечения патологических состояний
Общеклинический анализ крови – это первоочередное исследование, назначаемое больным при поступлении в муниципальные или частные клиники. Любые патологические изменения со стороны различных органов отражаются на составе крови.
Общеклиническое обследование кровиОбщеклинический анализ исследует количественные и качественные свойства красных форменных элементов и содержание в них белка гемоглобина. Квантитативное (количественное) определение гемоглобина в крови – важная составляющая работы лабораторных сотрудников, направленная на своевременное выявление анемии.
Красные форменные клетки вырабатываются (с помощью животных белков, железа и витаминов) в красном костном мозге и разрушаются под действием ферментов селезенки. Они выполняют жизненно важные функции – транспорт кислорода к тканям и утилизацию оксидов углерода. Повышенный или пониженный гемоглобин указывает на патологии органов различной этиологии. В предложенном ниже видео показан процесс переноса оксидов.
Строение и физиология гемоглобина
Гемоглобин – это четвертичная глобула, которая занимается утилизацией и поставкой оксидов в организме человека. Данное пептидное соединение является тетрамером, состоящим из четырех субъединиц. Одна полипептидная структура способна переносить через кровоток до четырех молекул кислорода.
Железосодержащий белокГемоглобин состоит из простетической группы и глобулина. Простетическую группу железосодержащего пептида принято называть «гемом». Благодаря гему кровь приобретает свойственный ей окрас – алый или синевато-красный. Простетическая группа содержит железо, которое участвует в восстановительно-окислительных процессах.
Различают несколько основных видов гемоглобина:
- Оксигемоглобин;
- Карбоксигемоглобин;
- Дезоксигемоглобин;
Оксигемоглобин образуется при присоединении кислорода к гемоглобину в условиях высокого парциального давления. При отщеплении кислорода от железосодержащего белка образуется устойчивая форма – дезоксигемоглобин. Карбоксигемоглобин появляется в результате присоединения монооксида или диоксида углерода. Стоит отметить, что монооксид углерода в 250 раз эффективнее связывается с железосодержащим белком, чем обуславливается его опасность для жизни при вдыхании (угарный газ).
Дезоксигемоглобин сильно токсичен для тканей человеческого организма, поэтому существуют специальные системы «ликвидации» гемоглобина в крови. Этим занимается особое пептидное соединение – гаптоглобин.
Определение количества гемоглобина по методу Сали
Метод базируется на свойстве железосодержащего белка превращаться в хлорид гематита под действием соляной кислоты. Методика Сали считается неинвазивным вмешательством.
Интенсивность цвета жидкости прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в крови. Раствор хлоргемина при проведении исследования разводят дистиллированной водой до стандартного цветового спектра.
Метод СаллиВажно! Стоит отметить, что гемоглобин по Сали не получил широкого распространения на территории РФ.
Метод, который применяется для определения уровня гемоглобина, принято называть «гемометром Сали». Другое название современного метода определения гемоглобина по Сали – гемоглобинометрия. Такой колориметрический аппарат состоит из специального штатива, который имеет три гнезда.
Боковые гнезда держат две склянки с веществами. Среднее гнездо данного прибора необходимо для размещения пронумерованной мензурки из стекла. Градуированная мензурка обладает шкалой с делениями, которые измеряют количество железосодержащего пептидного соединения в граммах на децилитр (г/дл). При клиническом исследовании крови используется специальная пипетка для воды и размешивания содержимого склянки.
При проведении полного анализа по методу Сали вначале в склянку наливается 0.10% раствор соляной кислоты. Потом выполняется забор исследовательского материала из кончика пальца в пипетку до отметки «0.04 мл». Впоследствии пипетку обтирают стерилизованной ваткой и размещают в мензурку с раствором HCl.
Медицинский сотрудник несколько раз встряхнет содержимое пробирки и поставит отстаиваться. Полное химическое превращение железосодержащего пептидного соединения в растворе соляной кислоты происходит не менее чем за 10-15 минут.
По истечении пяти минут оценивается цвет жидкости в гемометре со стандартными цветами. Как правило, он более темный, нежели в стандартных пробирках. Используя обычную пипетку к раствору постепенно добавляют чистую воду, попеременно перемешивая содержимое и сравнивая со стандартным цветом. На окончательном этапе цвет материала должен сравняться с нормативом. После всего вышеперечисленного замеряют уровень жидкости и проводят соответствующие подсчеты.
В промышленном масштабе выпускаются гемометры, которые содержат исключительно грамм-процентную градуированную шкалу. Нормой гемоглобина у мужчин и женщин принято считать значения 15 г%, или 168 г/дл. Но даже при соблюдении определенных правил наблюдаются небольшие погрешности в измерениях. В некоторых случаях разные результаты могут в значительной мере исказить данные о болезни.
Цианметгемоглобиновый метод определения содержания гемоглобина в крови
Стандартизированным и наиболее точным методом определения гемоглобина принято считать гемоглобинцианидный анализ. Такая методика базируется на свойстве железосодержащего пептидного соединения превращаться в цианметгемоглобин при добавлении к биологическому материалу определенного вещества.
Содержание цианметгемоглобина замеряют фотометрически. При анализе крови в роли реактива применяется раствор Драбкина. Железосодержащий белок под влиянием синеродисто-железистого калия превращается в метгемоглобин, который потом преобразуется в присутствии цианина калия в гемиглобинцианид.
Цианметгемоглобиновый методТипичное соотношение разведения биологического материала с реагентом — 2 : 500 (0,04 миллилитров капель крови и 10 мл реактива). По истечении 30 минут, которые нужны для полного преобразования железосодержащего пептида в гемиглобинцианид, измеряют «гашение» при длине волны в 550 нанометров и плюс толщине слоя в 2 см против воды на спектрофотометре СФ или на ФЭК и ему похожей технике. С помощью СФ также измеряют уровень свободного железосодержащего пептида в плазме.
На данный момент разработаны гемиглобинцианидные цветовые стандарты в ампулах, которые точно соответствуют определенному уровню железосодержащего белка. Растворы, полученные в результате определенных реакций, исследуют с помощью колориметрии. После всего рисуют рабочие таблицы и узнают, какое количество железосодержащего пептидного соединения содержится в кровотоке.
Есть устройства, специально созданные для определения количества гемоглобина. Зачастую используются именно циангемоглобиновые методы определения гемоглобина. Как правило, гемоглобинометрические приборы могут работать самостоятельно. Широкое применение такие тест-устройства для определения гемоглобина в крови получили в домашних условиях. Однако в ряде ситуаций больные не учитывают влияние внешних факторов в доме (стресса, еды).
Другой набор методов диагностики уровня гемоглобина в крови
Значительную известность и распространение среди различных лабораторий получила методика гемихром (или гемихромный метод). Принцип данного метода основан на преобразовании всех форм железосодержащего пептида в гемихром, который имеет красноватый цвет. Преимущество гемихромного метода заключается в том, что он не является токсичным.
Иногда назначают прохождение биохимического исследования на гликированный гемоглобин. Стоит отметить, что важное значение гликозилированный гемоглобин и глюкометр имеют при диагностике сахарного диабета.
ГлюкометрПри определенных состояниях в моче может содержаться гемоглобин, поэтому нередко данная биологическая жидкость и ее анализы являются важными частями диагностики различных заболеваний. Такое случается при переливании несовместимой крови от донора, в особенности у ребенка.
lechiserdce.ru
68. Колориметрический способ определения количества гемоглобина в крови. Количество гемоглобина в крови в норме у разных видов животных.
Объект исследования – кровь животных.
Материалы и оборудование – пробирки, гемометр Сали, пипетка от гемометра Сали, 0,1 н. раствор соляной кислоты, дистиллированная вода, вата, бинт.
Ход работы. Колориметрическое определение гемоглобина производится гемометром Сали, в комплект которого входят микропипетка и стеклянная палочка. Прибор состоит из пластмассового корпуса с тремя гнездами для пробирок. В задней стенке корпуса вмонтировано матовое белого цвета стекло, рассеивающее свет. В боковые гнезда вставлены одинакового размера запаянные пробирки со стандартно окрашенным раствором, а в среднее гнездо градуированная пробирка для исследуемой крови. На всех пробирках имеются две круговые контрольные метки, нижняя из них соответствует ѐмкости 0,2 мл, верхняя — 2 мл. Для определения гемоглобина в градуированную пробирку гемометра наливают 0,1 н. раствора соляной кислоты до нижней метки. В капиллярную пипетку, прилагаемую к прибору, насасывают 20 мм3 (0,02 мл) крови. Конец пипетки вытирают ватой, опускают ее на дно пробирки в раствор соляной кислоты и выдувают кровь. Не вынимая пипетки из пробирки, несколько раз промывают ее верхней частью раствора. После этого содержимое пробирки тщательно перемешивают и оставляют на 5 минут в штативе для полного гемолиза эритроцитов. Гемоглобин, вступая в реакцию с соляной кислотой, образует солянокислый гематин, который имеет коричневую окраску. Через 5 мин в пробирку по каплям, при постоянном помешивании стеклянной палочкой, добавляют дистиллированную воду до тех пор, пока цвет жидкости не совпадет с цветом стандартного раствора в пробирках, расположенных по бокам гемометра. Затем пробирку с полученным рабочим раствором достают из гемометра и смотрят на выгравированную на ней шкалу. По нижнему мениску жидкости определяют содержание гемоглобина в г%, если полученную цифру умножить на 10, то будет выражение количества гемоглобина в г.
Определение по методу Сали.
Колориметрическое определение гемоглобина производится гемометром Сали . Этот метод основан на образовании солянокислого-гематина из деци нормального раствора соляной кислоты и гемоглобина, который имеет коричневую окраску и доводится дистиллированной водой до цвета стандартных растворов. Гемометр состоит из штатива с тремя гнездами (рис).
Рис. Гемометр Сали.
Задняя стенка штатива представляет собой пластинку из матового стекла. В боковые гнезда вставлены одинаковые запаянные пробирки — цветные стандарты. Среднее гнездо с градуированной пробиркой для исследуемой крови. На пробирке нанесена шкала, показывающая количество гемоглобина в грамм % (т. е. сколько грамм гемоглобина содержится в 100 мл. крови). В градуированную пробирку наливают 0.1% раствор HCl до нижней круговой метки (0,2 мл). В капиллярную пипетку набирают 0,02 мл крови. Кровь, приставшую к кончику капилляра, удаляют ваткой. Опускают капилляр на дно градуированной пробирки и осторожно выдувают из него кровь так, чтобы верхний слой раствора остался прозрачным. Не вынимая капилляра из верхнего слоя раствора, 2-3 раза промывают его. После этого содержимое пробирки тщательно перемешивают и оставляют на 5 минут в штативе для полного гемолиза эритроцитов. Гемоглобин, вступая в реакцию с соляной кислотой, образует солянокислый гематин, который имеет коричневую окраску. Затем к раствору по каплям прибавляют дистиллированную воду и перемешивают стеклянной палочкой до получения одинакового окрашивания со стандартом. Деление на шкале, до которого поднялась жидкость, позывает количество гемоглобина. Грамм-процент переводят умножения полученный результат на 10, что соответствует содержанию гемоглобина в 1 л крови (г/л).
Состав крови у здоровых сельскохозяйственных животных
69. Определение времени свертывания крови. Противосвертывающая система крови в организме Свертывание крови – защитная биологическая реакция, предохраняющая организм животного и человека от потери крови. Свертывание крови является сложным процессом, в котором участвует свыше 15 факторов (рис.). Свертывание – переход крови из жидкого состояния в желеобразное. Оно происходит при повреждении сосуда и сопровождается образованием тромба. При травме происходит спазм сосуда и выделение серотонина – это приводит к гемостазу. Кровь может свернуться и в неповрежденном кровеносном сосуде, что вызывает нарушение ее циркуляции и кровоснабжения отдельных тканей и органов, поэтому в организме имеется противосвертываюшая система крови, препятствующая свертыванию ее в кровеносных сосудах.
Рис. Классическая схема свертывания крови Шмидта — Моравица.
Нанести по одной капле крови, вытекающей из надрезанного уха животного, на три предметных стекла. Одно стекло поместить в термостат при +40оС, другое стекло положить на стол (при комнатной температуре), третье — на снег. Через каждую минуту наклонять стекла с кровью и повторять до тех пор, пока кровь не свернется. Определить время свертывания крови у различных животных. К противосвертывающей системе относят: Антитромбопластины, антитромбины, гепарин, различные соли кислот. Система свертывания находиться под постоянным контролем нейрогуморальной регуляции(при страхе , боли, теипиратуре свертывание крови усиливается. Адреналин и норадреналин освобождают тромбопластин из стенок сосудов).
studfiles.net
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГЕМОГЛОБИНА КРОВИ, ПОЛУЧЕНЫХ РАЗНЫМИ МЕТОДАМИ
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГЕМОГЛОБИНА КРОВИ, ПОЛУЧЕНЫХ РАЗНЫМИ МЕТОДАМИ
Чибескова Мария Витальевна
студент 32 группы отделения «Лабораторная диагностика» ГБОУ СПО «ММУ № 4 ДЗМ», РФ, г. Москва
E-mail:
Меклер Наталия Николаевна
канд. биол. наук, Доцент, преподаватель дисциплин профессионального модуля ГБОУ СПО «ММУ № 4 ДЗМ», РФ, г. Москва
Общий анализ крови считается одним из самых доступных, простых и информативных методов исследования, которые применяются у людей любого возраста, начиная с момента рождения. В медицинской терминологии это исследование называют клиническим анализом крови.
Основной индекс клинического анализа крови — содержание гемоглобина. До сих пор его определение является одним из наиболее важных и массовых показателей, так как играет важнейшую роль в диагностике большого числа заболеваний связанных с нарушениями в иммунной системе и нарушением всасывания железа в желудочно-кишечном тракте. Следует отметить, что значения гемоглобина очень важно и при диагностике ранних стадий многих тяжелых заболеваний, таких как сахарный диабет, доброкачественные и злокачественные новообразования в печени, почках, центральной нервной системе.
В настоящее время существует много методов определения концентрации гемоглобина. Колориметрические методы, принцип которых заключается в изменении цвета производных гемоглобина: солянокислого гематина, карбоксигемоглобина, цианметгемоглобина. Газометрические методы, позволяют судить о содержании гемоглобина по количеству газа, которым насыщают гемоглобин, например кислород или окись углерода. Методы, основанные на определении железа в гемоглобиновой молекуле. Так как гемоглобин содержит строго определенное количество железа (0,374 %), то по его содержанию устанавливают и количество гемоглобина [4, с. 243—247].
Для рутинных исследований содержания гемоглобина сегодня предпочитают колориметрические методы как наиболее дешевые, простые и быстрые в использовании. Наиболее распространенным является гемоглобинцианидный метод, проводимый на гемометрах разного типа. В ряде лабораторий до сих пор применяют «старый» метод Сали [3, с. 340—343].
В связи с этим мы поставили перед собой цель: сравнить результаты, полученные при исследовании проб крови на содержание гемоглобина (n=3) по методу Сали и гемоглобинцианидным методом на гемометре «МиниГЕМ-540».
Из указанной цели были определены задачи:
1. Изучить роль гемоглобина в организме человека;
2. Освоить колориметрический и гемоглобинцианидный метод исследования содержания гемоглобина в крови человека;
3. Провести исследование проб крови на содержание гемоглобина заявленными методами;
4. Обработать полученные результаты и сделать выводы.
Начиная работу, мы выдвинули гипотезу: результаты исследования содержания гемоглобина гемоглобинцианидным методом на анализаторе дает более точные результаты, чем полученные при исследовании традиционным методом на приборе Сали.
Объектом исследования явилась венозная кровь.
Предметом исследования — содержание гемоглобина в ней.
Материалы и методы исследования .
Исследования проводились в условиях клинико-диагностической лаборатории «ГКБ №7 ДЗМ». Материалом для эксперимента стали пробы венозной крови с антикоагулянтом ЭДТА, поступившие в лабораторию 17 марта 2014 года из 16-го гинекологического отделения указанного лечебного учреждения. Нами были отобраны пробы больных разного возраста: 27, 52 и 75 лет. Каждую пробу крови мы оценивали двумя способами: гемоглобинцианидным используя гемометр «МиниГЕМ-540 и гемометр Сали. Полученные результаты сравнивали с результатами, полученными в условиях лаборатории на геатологическом анализаторе Becman Culter ActDif. Таким образом было проведенно 6 самостоятельных исследований и сделан сравнительный анализ.
Гемоглобин представляет собой кровяной пигмент, роль которого заключается в транспорте кислорода к органам и тканям, транспорте двуокиси углерода от тканей к легким, кроме этого он является внутриклеточным буфером, который поддерживает оптимальную для метаболизма pH. Химически гемоглобин относится к группе хромопротеидов. Его простетическая группа, включающая железо, называется гемом, белковый компонент — глобином (молекула гемоглобина содержит 4 гема и 1 глобин). Существуют физиологические и патологические виды гемоглобина. К физиологическим гемоглобинам относятся НЬА (гемоглобин взрослого) и HbF (фетальный гемоглобин, составляющий основную массу гемоглобина плода и исчезающий почти полностью ко 2-му году жизни ребенка). Патологические гемоглобины возникают в результате врожденного, передаваемого по наследству дефекта образования гемоглобина и являются основой развития гемоглобинопатий, относимых к «молекулярным болезням». Нормальные величины содержания гемоглобина : у мужчин 130—160 г/л; у женщин; 120—140 г/л [2, с. 160—172; 1, с. 45—46].
Принцип метода Сали: от прибавления к крови соляной кислоты гемоглобин превращается в хлоргемин (солянокислый гематин) коричневого цвета, интенсивность которого пропорциональна содержанию гемоглобина. Полученный раствор солянокислого гематина разводят водой до цвета стандарта, соответствующего известной концентрации гемоглобина. Определение проводят в упрощенном колориметре — гемометре Сали.
Принцип гемоглобинцианидного фотометрического метода: кровь смешивают с реактивом, превращающим гемоглобин в цианметгемоглобин, концентрацию которого измеряют фотометрически. В качестве реактива употребляют раствор Драбкина, под влиянием железосинеродистого калия гемоглобин окисляется до метгемоглобина (гемиглобина), который затем превращается при помощи цианида калия в цианметгемоглобин (гемиглобинцианид). Через 20 минут измеряют экстинцию при длине волны 540 нм и толщине слоя 1 см на различных фотоэлектроколориметрах.
Результаты исследования показали следующее. Факт содержания гемоглобина крови определенного «старым» методом представлен в таблице 1.
Таблица 1.
Содержание гемоглобина в крови определенного по методу Сали
Пациент | Норма г/л | Уровень Hb | |
г/% | г/л | ||
1 | 120,0—140,0 | 11,0 | 110,0 |
2 | 12,2 | 122,0 | |
3 | 13,0 | 130,0 | |
Как видно из представленных данных, полученные результаты находятся в пределах референсных величин. Оценивая показатель мы ориентировались на промышленную грамм — процентную шкалу, получали целочисленный результат в грамм – процентах и переводили его в единицы СИ: грамм/литр.
Уровень содержания гемоглобина в опытных образцах крови определенный гемоглобинцианидным методом представлен в таблице 2.
Таблица 2.
Содержание гемоглобина в крови определенного гемоглобинцианидным методом
Пациент | Норма г/л | Уровень Hb г/л |
1 | 120,0—140,0 | 108,4 |
2 | 121,3 | |
3 | 128,4 |
Как показывают данные таблицы 2, полученные результаты не принципиально отличаются от данных таблицы 1. Они также находятся в пределах референсных величин. Но надо отметить, что данный метод дает более точные результаты, выражаемые десятыми долями.
Сравнение полученных результатов приведены в таблице 3 и диаграмме 1.
Таблица 3.
Сравнительный анализ содержания гемоглобина крови, полученных разными методами
Пациент | Норма, г/л | Уровень Hb г/л | |
Метод Сали | Гемоглобинианидный метод | ||
1 |
120,0-140,0 | 110,0 | 108,4 |
2 | 122,0 | 121,3 | |
3 | 130,0 | 128,4 | |
Диаграмма 1. Сравнительный анализ содержания гемоглобина крови полученных разными методами
Как видно и табличного и графического материала данные розняться. Результаты, полученные при выполнении анализа «старым» методом, завышены. Так у первой пациентки уровень гемоглобина по методу Сали выше, чем таковой при исследовании гемоглобинцианидным методом на «МиниГЕМе-540» на 1,45 % или 1,6 г/л. У второй пациентки на 0,6 % или 0,7 г/л соответственно. У третьей пациентки на 1,3 % или 1,6 г/л. Мы считаем, что источником такой ошибки (получение завышенных цифр) является выцветание с течением времени цветных стандартов гемометров. Так как все остальные условия выполнения методики нами соблюдались точно.
Для подтверждения правильности полученных результатов мы сравнили полученные нами величины с результатами определенными в условиях лаборатории. Исследования в ней проводятся на анализаторе Becman Culter Act Dif. Данные представлены в таблице 4, диаграмме 2.
Таблица 4.
Сравнительный анализ экспериментальных величин с результатами полученными в лаборатории
Пациент | Уровень Hb г/л | ||
Метод Сали | Гемоглобинианидный метод «Минигем-540» | Гемоглобинцианиный метод Becman Culter Act Dif | |
1 | 110,0 | 108,4 | 107,57 |
2 | 122,0 | 120,9 | 120,21 |
3 | 130,0 | 128,4 | 128,32 |
Диаграмма 2. «Сравнительный анализ экспериментальных величин с результатами полученными в лаборатории»
При сравнении полученных показателей мы отметили следующее. Результаты, полученные на геманализаторе Becman Culter Act Dif, практически совпадают с результатами, полученными при исследовании проб на анализаторе «МиниГем-540». Так, у первой пациентки он ниже на 0,83 %, у второй на 0,90 %, у третьей на 0,07 %.Тогда как разница с результатами старого метода составляет 2,27, 1,48 и 1,38 % соответственно у первой, второй, третьей пациентки.
Таким образом, проведенные нами исследования позволяют сделать вывод о том, что результаты содержания гемоглобинцианидного метода наиболее точные, так как практически не имеют расхождения друг с другом и выражаются десятыми и сотыми долями. Тогда как, результаты, полученные при проведении «старого» метода, выражаются целыми числами. Однако, ошибка при получении результатов незначительная и колеблется в пределах допустимых 2 %.
Исходя из выше изложенного, можно говорить о том, что все проверяемые нами методы при определенных обстоятельствах (отсутствие света, расходных материалов, поломка автомотического геманализатора и другое) можно использовать при организации проведения клинического анализа крови, а именно для определения концентрации гемоглобина.
Список литературы:
1.Долгов В.В., Морозова В.А. Клинико-диагностическое значение лабораторных показателей./ В.В. Долгов, В.А. Морозова. М.: Медицина, 1997. — 234 с.
2.Зинчук В.В. Нормальная физиология. Краткий курс. М.: Медицина, 2009. — 405 с.
3.Методы клинических лабораторных исследований./Под редакцией Камышникова В.С. М.: «МЕДпресс-информ», 2011. — с. 751.
4.Руководство по гематологии/ под ред. А.И. Воробьева. М.: Медицина, — 2003. — Т. 1. — 280 с.
sibac.info
Определение количества гемоглобина.
Количество гемоглобина можно определить или спектроскопически, посредством определения количества железа, или путем измерения красящей способности крови (колориметрически).
Для клинических целей используется последний метод, который требует небольшого количества крови и дает возможность быстро определить количество гемоглобина. Наиболее распространенным является метод Говерса в видоизменении Сали.
Определение гемоглобина по Сали основано на том, что гемоглобин крови в растворе соляной кислоты переходит в солянокислый гематин, который и сравнивается с гематином определенной концентрации, взятом в качестве стандарта. Процент гемоглобина в этом случае определяется колориметрически.
Набор Сали состоит из запаянной стандартной пробирки, наполненной раствором солянокислого гематина. Ввиду того, что стандартная жидкость довольно быстро выцветает, в последнее время выпущены стандарты из цветного стекла, окрашенные под цвет солянокислого гематина металлическими окислами. Эти стандарты не выцветают даже под действием прямого солнечного света.
Между стандартными пробирками помещается пробирка, имеющая деления от 10 до 140 или от 10 до 170 такого же диаметра, как и первая. Пробирка с делением от 10 до 140 предназначена для определения гемоглобина в единицах Сали, а от 10 до 170—в процентах.
Подставка, в которой помещаются стандартные и градуированные пробирки, представляет собою деревянную колодку с вырезанными продольными отверстиями и углублениями для них. Сзади колодки прикреплено матовое стекло, которое дает рассеянный свет; на его фоне резко оттеняется окраска стандарта и испытуемой сыворотки.
Для взятия крови прилагается капиллярная пипетка с меткой 20 мм, которая определяет количество крови, взятой для исследования.
Кроме гемоглобинометра, для определения гемоглобина необходимо иметь N/10 раствор НС1 и дистиллированную воду.
Техника определения следующая. В градуированную пробирку до метки 20 набирается N/10 раствор НС1, затем в капилляр до метки 20 мм3 насасывается кровь и, осторожно очистив конец капилляра, переносят ее в пробирку
|
Рис. Гемоглобинометр Сали. |
С соляной кислотой. Кровь осторожно выдувают в А710 раствор соляной кислоты, содержимое пробирки из верхнего прозрачного слоя набирается в капилляр и снова выдувается в пробирку.
Капилляр промывается 2 или 3 раза и осторожно удаляется из пробирки. Кровь гемолизируется, и при распаде образуется солянокислый гематин. Жидкость постепенно становится коричневой. Спустя 5—7 минут после выдувания крови, в пробирку начинают прибавлять дистиллированную воду. Вначале прибавляют по нескольку капель, а затем, по мере изменения цвета и приближения его к стандарту,—то одной капле. Кровь смешивается или стеклянной палочкой с утолщением на конце или же покачиванием прсбирочки. Необходимо следить за тем, чтобы жидкость при смешивании не терялась.
Уровень жидкости после разведения указывает на количество гемоглобина. Учет ведется по нижнему мениску жидкости. Допустимой ошибкой при вторичном исследовании той же самой крови считается расхождение в пределах пяти делений. Метка 80 на пробирке с делением до 140 и цифра 100 на пробирке с делением до 170 соответствует 16,0—17,0 гемоглобина в 100 мл крови. Чтобы получить абсолютную цифру, показывающую количество гемоглобина в граммах в 100 мл крови, необходимо показания гемометра в процентах Сали умножить на 0,17, а количество в единицах— на коэффициент 0,2125.
|
Вид животного |
Средний показатель в % Сали |
Колебания |
В 100 мл крови в г |
Фамилия автора |
|
Крупный рогатый скот…. Овцы Козы Буйволы Яки Верблюды Лошади Свиньи Собаки Кошки Кролики Куры Гуси |
65 68 63 49 57 90 80 67 80 65 69 75 95 |
56—74 54—80 45—81 28—70 36—78 66—114 50—110 55—79 65—95 47—83 51—87 51—99 80—110 |
11,0 11,6 10,7 8,3 9,6 15,2 13,6 10,2 13,6 11,0 11,7 12,7 16,1 |
Д. Соколов Л. Лебедев B. Чагин К. Мавсун-Заде П. Карасев Н. Семушкин C. Хрусталев A. Васильев B. Зайцев C. Веремейчик |
Количество гемоглобина у здоровых животных колеблется в следующие пределах (см. табл. на стр. 418).
Колебания гемоглобина зависят от возраста, пола, породы, характера кормления и некоторых других условий. При патологических процессах количество гемоглобина может быть увеличено и уменьшено по сравнению с нормальными показателями.
Увеличение количества гемоглобина носит название плейохромии. Она может возникнуть вследствие сгущения крови при потере жидкости организмом (понос, рвота, потливость), при образовании экссудатов и транссудатов, Плейохромию отмечают при кровепятнистой болезни лошадей, интоксикациях и отравлениях. Повышение количества гемоглобина отмечается при физическом напряжении лошади. При хорошей подготовке (тренировка) количество гемоглобина остается почти без изменений.
Уменьшение гемоглобина (олигохромемия) встречается довольно часто и особенно при заболеваниях, связанных с анемией. Олигохромемия является симптомом острых и хронических заболеваний, различных по своему происхождению.
Олигохромемия связана с уменьшением общего количества эритроцитов или обеднением эритроцитов гемоглобином. Следовательно, олигохромемия определяет не только степень, но и характер анемии. Необходимо, однако, учесть, что правильная оценка может быть сделана только при условии подсчета эритроцитов и определения величины цветного показателя.
Определение цветного показателя. Цветной показатель дает представление об отношении гемоглобина к красным кровяным тельцам. Метод определения цветного показателя основан на сравнении. Если в норме цветной показатель равен примерно единице, то изменение этой цифры в сторону увеличения или уменьшения рассматривается, как весьма важный показатель нарушения соотношения между эритроцитами и гемоглобином.
У животных определение цветного показателя проводится по формуле:
Гемоглобин 2 Эритроциты 2 Гемоглобин 2 х эритроциты 1
Гемоглобин 1 / эритроциты 1 = гемоглобин 1 x эритроциты 2
Где гемоглобин 1 и эритроциты 1 показывают среднее количество гемоглобина и эритроцитов у здорового животного и гемоглобин 2 и эритроциты 2—найденное количество гемоглобина и эритроцитов у исследуемых животных. Если у лошади взять за норму количество гемоглобина 75, а эритроцитов 7 500 000, то цветной показатель будет равен единице. Всякое отклонение в количестве гемоглобина и эритроцитов поведет к изменению цветного показателя. Необходимо учитывать только такие отклонения от нормы, которые превышают 15%. Небольшие отклонения учитывать не следует.
Определение цветного показателя имеет значение в дифференциации анемий. При постгеморрагических анемиях, когда имеется одновременно уменьшение как количества эритроцитов, так и гемоглобина, цветной показатель приближается к единице; ниже единицы цветной показатель бывает при вторичных анемиях, при которых снижается количество гемоглобина, при почти нормальном или слегка сниженном количестве эритроцитов; выше единицы цветной показатель отмечается при гемолитических анемиях, когда в ток крови выбрасывается значительное количество молодых клеток (повышенная регенерация).
Для суждения о средней насыщенности эритроцитов гемоглобином практически можно использовать определение кровяного числа. Оно получается делением найденного количества гемоглобина на число эритроцитов в миллионах, например:
75% / 7(000000) = 11 или 90% / 10(000000) =9
Величина кровяного числа неодинакова у различных животных и зависит от количества эритроцитов и гемоглобина в норме, но в среднем она приближается к 10.
veterinarua.ru