Серологическая диагностика: Серологические методы анализа | UNIMED laboratories

Серологические исследования

190 р.

РМП с кардиолипиновым АГ в сыворотке крови, ликворе (качественное исследование)

190 р.

Скрининговый нетрепонемный тест, выявляющий антитела к липоидному и липопротеиноподобному материалу, высвобождаемому из повреждённых клеток больного сифилисом.Тест рекомендован приказом МЗ РФ для первичного скрининга и наблюдения за ходом лечения сифилиса.Антифосфолипидные антитела, выявляемые этим тестом, находят у 70 — 80% лиц с первичным сифилисом и почти у 100% пациентов с вторичным и ранним латентным сифилисом. В большинстве случаев позитивная реакция наблюдается через 7 — 10 дней после появления первичного шанкра или через 3 — 5 недель после инфицирования. Титры снижаются после наступления вторичной стадии сифилиса. Около 30% пациентов с поздним сифилисом становятся нереактивными. Снижение титра в 4 и более раз в течение 1 года после проведённой терапии подтверждает её эффективность. В 90 — 98% случаев после лечения сифилиса результат теста становится отрицательным.

Тест не является специфическим. Поэтому иногда возможно возникновение ложноположительных реакций. Антилипоидные антитела могут появляться не только вследствие сифилиса или других трепонемных инфекций, но и в ответ на развитие нетрепонемных заболеваний острой или хронической природы, при которых наблюдается повреждение тканей (особенно часто при аутоиммунных заболеваниях).При получении положительного результата в, пациент должен обследоваться дерматовенерологом с повторным исследованием крови с помощью специфического трепонемного диагностического теста Редкие ложноотрицательные результаты в реакции РМП (эффект «прозоны» при очень высоких титрах реагиновых антител) могут быть исключены одновременным назначением теста сифилис ИФА IgG/IgM. Эти два исследования являются взаимодополняющими; комбинированное использование тестов РМП и ИФА-теста IgG/IgM представляет лучший вариант скринингового исследования для обнаружения или исключения сифилиса на всех стадиях.Особенности инфекции. Сифилис — хроническое инфекционное заболевание, характеризующееся мультисистемным поражением организма. Возбудитель сифилиса — Treponema pallidum — неустойчива в окружающей среде, но хорошо сохраняется во влажных биологических материалах (сперме, влагалищном секрете, слизи, гное и др.). Передаётся половым, парентеральным, бытовым, трансплацентарным путями. Увеличивают риск заражения другие инфекции, передающиеся половым путём: герпес, хламидиоз, папилломавирусная инфекция и др., а также повреждение слизистой оболочки при анальных контактах. Бледная трепонема имеет несколько антигенов, обусловливающих выработку антител. Один из них аналогичен кардиолипину, что позволяет использовать последний для обнаружения иммунитета к бледной трепонеме.Заражение от больного человека возможно в любом периоде сифилиса. Наиболее инфекционными являются первичный и вторичный сифилис при наличии активных проявлений на коже и слизистых оболочках. Бледная трепонема проникает через микроповреждения кожи или слизистых в лимфатические сосуды, затем в лимфатические узлы. Далее возбудитель распространяется по органам и может определяться во всех биологических средах (слюне, грудном молоке, сперме и т.д.).При классическом течении инкубационный период длится 3 — 4 недели, первичный серонегативный — 1 месяц, затем первичный серопозитивный — 1 месяц, затем вторичный период — 2 — 4 года, далее третичный период. В первичном периоде возникает твёрдый шанкр (безболезненная язва или эрозия с плотным дном в месте проникновения бледной трепонемы), сопровождающийся регионарным лимфангиитом и лимфаденитом. В конце первичного периода шанкр самостоятельно заживает, а лимфаденит переходит в полиаденит и сохраняется до пяти месяцев. Первое генерализованное высыпание является признаком начала вторичного периода. Вторичные сифилиды появляются волнообразно (на 1,5 — 2 месяца каждая волна) и самостоятельно исчезают. Могут быть представлены пятнистыми, папулезными, пустулезными сифилидами, сифилитической аллопецией (облысением) и сифилитической лейкодермой («ожерелье Венеры»). На втором полугодии вторичного сифилиса исчезает полиаденит.Появление третичных сифилидов (бугорков и гумм) знаменует начало третичного периода, который наступает у 40% нелеченных и неполноценно леченных больных. Волны третичного периода разделены более продолжительными (иногда многолетними) периодами латентного течения инфекции. В поражённых органах и тканях возникают деструктивные изменения. В третичных сифилидах содержится крайне мало трепонем, поэтому они практически не заразны. Напряжённость иммунитета падает (т. к. уменьшается количество бледных трепонем), поэтому становится возможным новое инфицирование (ресуперинфекция).Передача сифилиса потомству наиболее вероятна в первые три года заболевания. В результате возникают поздние выкидыши (на 12 — 16 неделе), мертворождение, ранний и поздний врождённый сифилис. Поражение плода наиболее вероятно на 5-м месяце беременности и в родах. Проявления раннего врождённого сифилиса возникают сразу после рождения и аналогичны проявлениям вторичного сифилиса. Сифилиды позднего врождённого сифилиса возникают в возрасте 5 — 17 лет и аналогичны проявлениям третичного сифилиса. К безусловным признакам относится триада Гетчинсона (гетчинсоновские зубы, паренхиматозный кератит, лабиринтная глухота).Диагноз сифилиса должен быть подтвержден лабораторными исследованиями, однако, в некоторых случаях может быть обоснован, несмотря на отрицательные результаты серологических реакций.

Серологические исследования – Медцентр ЕЛАМЕД

Диагностика является важнейшим этапом в лечении любого заболевания. В зависимости от правильно поставленного диагноза находится не только успешное лечение, но и возможность предотвратить развитие осложнений и сопутствующих патологий.

Серологическое исследование — это метод диагностического анализа биологического образца пациента на предмет наличия антител и антигенов. Тест позволяет выявить десятки заболеваний, фазу болезни и контролировать лечение.

Для чего назначается исследование?

• Изосерологическое исследование направлено на определение группы крови, резус-фактора и других параметров крови пациента.
• Серологический анализ крови используется в гинекологии для выявления заболеваний, передающихся половым путем. Также серологическое титрование используется для комплексного обследования будущих мам (токсоплазмоз, ВИЧ, сифилис и пр.). При постановке на учет беременных, это обязательный тест.
• В педиатрии серологические реакции применяются для подтверждения диагноза «детских» болезней (ветрянка, краснуха, корь и пр.), если симптомы выражены не ярко и нет возможности определить недуг по клиническим показаниям.
• Серологические исследования позволяют венерологам быстро и безошибочно ставить диагноз. При схожих симптомах и жалобах анализ крови позволяет выявить антитела к сифилису, лямблиозу, уреплазмозу, хламидиозу, герпесу и другим заболеваниям.
• Гастроэнерологи, гепатологи и инфекционисты используют серологический анализ крови для диагностики вирусного гепатита.
• Подозрение на любое инфекционное или вирусное заболевание может возникнуть у терапевта.
  Для подтверждения используются серологические реакции на специфические антитела в организме. Проводится анализ на энцефалит, бруцеллез, коклюш, вирус Денге, вирус иммунодефицита, аллергию и пр.
• Серологическая диагностика для госпитализации играет важную роль. Этот метод диагностики может показать, на какой стадии развития находится болезнь, и требуется ли немедленное оформление в стационар или достаточно амбулаторного лечения.

Достоинства и недостатки серологии:

Диагностика с применением серологических методов широко используется в современной медицине. Особенно актуален этот тест при выявлении вирусных и инфекционных заболеваний. Этот же тип анализов используется при географических скринингах и медицинских обследованиях для предотвращения эпидемиологических вспышек.

Серологические анализы имеют ряд преимуществ:

• Серологический тест любого типа имеет высокую достоверность.
• Анализы на серологию проводятся достаточно быстро. Результат РСК известен уже через сутки, а получить его можно посредством интернета, не выходя из дома. В особых случаях при стационарном лечении тест проводится в течение нескольких часов.
• РСК позволяет контролировать развитие болезни, и отслеживать эффективность проводимого лечения.
• Серологические методы исследования отличаются невысокой стоимостью и доступны пациентам.

Серологические анализы имеют и некоторые недостатки:

• Для того, чтобы обследование дало максимально достоверную информацию анализ крови следует проводить с учетом времени инкубационного периода болезни.
• На достоверность исследования может повлиять человеческий фактор. Если пациент пренебрегает правилами подготовки к исследованию или лаборант допустил ошибку в обработке образца крови, возможно получение ложного или сомнительного результата. Такая ситуация возникает приблизительно в 2% случаев. Как правило, лечащий врач на основании клинических показаний легко вычисляет ошибку РСК.

Диагностика заболеваний по результатам серологии

Серологическое исследование крови современный и надежный способ выявления таких опасных заболеваний как ВИЧ, гепатит, бруцеллез, ЗППП и пр. Этот раздел медицины направлен на изучение плазмы крови человека и ее иммунологических свойств. 

Диагностические методы: серологические и молекулярные подходы

• Список журналов
• Коллекция Elsevier для чрезвычайных ситуаций в области общественного здравоохранения
• PMC7150332

Энциклопедия вирусологии. 2008: 29–37.

Опубликовано в Интернете 30 июля 2008 г. doi: 10.1016/B978-012374410-4.00585-9

PMCID: PMC7150332

Приглашенный редактор (ы): Brian W. J. Mahy

Старший научный советник, Отдел новых инфекций и служб наблюдения, Центры по контролю и профилактике заболеваний, Атланта, Джорджия, США

1 Приглашенный редактор (ы): Марк Х.В. Van Regenmortel

Почетный директор CNRS, Французский национальный центр научных исследований, Школа биотехнологии Страсбургского университета, Илькирш, Франция

Информация об авторских правах и лицензиях Отказ от ответственности

Вирусная лабораторная диагностика играет все более важную роль в современном лечении пациентов. Вирусологические методы необходимы для изучения этиологии острой вирусной инфекции или реактивации латентной инфекции, а также для отслеживания вирусной нагрузки при противовирусном лечении. Серологические анализы также используются для скрининга продуктов крови на риск некоторых хронических инфекций, оценки иммунного статуса и необходимости профилактического лечения в связи с трансплантацией органов.

В диагностических целях могут быть использованы следующие подходы: демонстрация присутствия инфекционного вируса или его структурных компонентов непосредственно в образцах пациента или исследование специфического ответа антител в образцах сыворотки. Выделение вируса используется для демонстрации инфекционного вируса в образцах пациента, тогда как методы амплификации нуклеиновых кислот, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), широко используются для обнаружения нуклеиновых кислот вируса. Вирусные антигены исследуют с помощью анализов обнаружения антигена. Серологический диагноз основывается либо на демонстрации наличия вирусспецифических антител IgM, либо на значительном повышении уровня специфических антител IgG. Иммуноанализы являются наиболее часто используемыми серологическими анализами. Тесты по месту оказания медицинской помощи (тесты POC), как на антигены, так и на антитела, также становятся все более распространенными в диагностических целях.

Для достижения максимальной эффективности диагностики для каждого пациента важно выбрать наиболее подходящий метод с использованием правильного образца, взятого в нужное время.

Ключевые слова: Реакция связывания комплемента, Диагностическая вирусология, Иммуноферментный анализ (ИФА), Реакция ингибирования гемагглютинации, Микрочип, Реакция на нейтрализующие антитела, Методы амплификации нуклеиновых кислот, ПЦР, ПЦР в реальном времени, Серологический анализ, Флуороиммуноанализ с временным разрешением, Вирус анализ обнаружения антигена

Специфическую вирусную диагностику можно использовать для определения этиологии острой вирусной инфекции или реактивации латентной инфекции. Можно использовать два подхода: демонстрация специфического ответа антител или присутствия самого вируса. Серологические методы используются для измерения ответа антител, в то время как присутствие вируса может быть продемонстрировано путем культивирования или демонстрации специфических антигенов или последовательностей генов. Для последних все шире применяются методы молекулярной диагностики.

В этой статье мы кратко описываем принципы наиболее важных серологических методов и молекулярных приложений, которые используются для получения информации о вирусной этиологии клинического состояния, предположительно вызванного вирусной инфекцией.

Схема течения острой вирусной инфекции ( ) указывает на оптимальные методы вирусной диагностики. После передачи вирус начинает размножаться, и после инкубационного периода появляются клинические симптомы с одновременным выделением инфекционного вируса. Вирусспецифические антитела появляются несколько позже (от нескольких дней до недель, что называется периодом окна). Когда продукция вирусспецифических антител достигает уровня обнаружения, сначала появляются антитела иммуноглобулина M (IgM), а через несколько дней — антитела иммуноглобулина G (IgG), и количество инфекционного вируса начинает уменьшаться. Если это первая встреча с этим конкретным вирусом, то есть первичный иммунный ответ, уровни антител IgG могут оставаться на относительно низком уровне, тогда как при более позднем контакте с тем же антигеном, то есть при вторичном ответе, уровни IgG повышаются. быстро и достигают высоких уровней, в то время как ответ IgM может вообще не обнаруживаться. Антитела обычно исследуют из образцов сыворотки, взятых в острой фазе инфекции и в период выздоровления. В отдельных случаях могут быть проанализированы и другие материалы, такие как спинномозговая жидкость и другие биологические жидкости.

Открыть в отдельном окне

Течение вирусной инфекции. Выделение инфекционного вируса после инкубационного периода и типичный ответ антител. Обозначены рекомендуемые лабораторные методы диагностики.

Наличие инфекционного вируса или структурных компонентов вируса можно исследовать непосредственно из различных клинических образцов либо путем выделения вируса, либо с помощью анализа обнаружения нуклеиновых кислот, либо анализа обнаружения антигена. Чтобы поставить наилучший диагноз для каждого пациента, важно выбрать наиболее подходящий метод с использованием правильного образца, взятого в нужное время.

При большинстве первичных инфекций уровни антител IgM достигают пика через 7–10 дней после начала заболевания, а затем начинают снижаться, исчезая через несколько недель или месяцев. IgM-ответ обычно не выявляется при реактивации инфекций или реинфекциях. Выработка антител IgG начинается через несколько дней после ответа IgM, и эти антитела часто сохраняются на протяжении всей жизни.

Серологический диагноз обычно основывается либо на демонстрации присутствия специфических антител IgM, либо на значительном повышении уровней специфических антител IgG между двумя последовательными образцами, взятыми с интервалом 7–10 дней. Антигеном для теста может быть как жизнеспособный, так и инактивированный вирус или некоторые его компоненты, приготовленные вирусологическими или молекулярными методами. Специфичные для изотипа маркеры или физическое разделение используются для демонстрации изотипа реагирующего антитела. В некоторых случаях определяются даже специфичности подклассов IgG, хотя они имеют ограниченное значение в диагностической работе.

В ранней фазе острой инфекции специфическая авидность IgG-антител обычно низкая, но повышается по мере созревания ответа. Диагностические приложения измерения авидности антител IgG против специфических антигенов были разработаны, чтобы помочь отличить серологические ответы, вызванные острыми инфекциями, от ответов хронических или перенесенных инфекций.

Серологические анализы полезны для многих целей. При первичных инфекциях они часто дают информацию об этиологии даже после острой стадии, когда инфекционный вирус или его компоненты больше не могут быть обнаружены в образцах. Они широко используются для скрининга продуктов крови на риск некоторых хронических инфекций, оценки иммунного статуса и необходимости профилактического лечения в связи с трансплантацией некоторых органов. Они также широко используются для эпидемиологических исследований, определения вакциноиндуцированного иммунитета и других подобных целей общественного здравоохранения.

Серологические анализы имеют свои ограничения. При некоторых инфекциях ответ антител недостаточно силен или ограниченная специфичность антигенов, используемых в анализе, не позволяет однозначно интерпретировать результаты. При инфекциях новорожденных наличие материнских антител может сделать невозможным проявление реакции у ребенка. У пациентов с ослабленным иммунитетом серологический ответ часто слишком слаб, чтобы можно было продемонстрировать специфические ответы. В этих случаях следует рассмотреть другие вирусологические методы.

Другие клинические образцы, кроме сыворотки, могут использоваться для анализа антител. Определение антител IgM и IgG в спинномозговой жидкости используется для диагностики вирусных инфекций в центральной нервной системе, хотя их все чаще заменяют новые молекулярные методы. В последнее время все большее внимание уделяется использованию неинвазивных образцов материалов, таких как слюна или моча. Они становятся важными для целей общественного здравоохранения, но их ценность для диагностики отдельных пациентов все еще ограничена.

Анализ нейтрализующих антител

Антитела, снижающие инфекционную способность вируса, называются нейтрализующими антителами. Они образуются при острой инфекции и часто сохраняются в течение всей жизни. Они также полезны в качестве индикатора иммунитета. В нейтрализации участвуют антитела IgM и IgG.

В анализе известные количества инфекционного вируса смешивают с образцом сыворотки и инкубируют в течение короткого периода времени, после чего измеряют остаточную инфекционность с использованием клеточных культур или подопытных животных. Затем эту инфекционность сравнивают с инфекционностью исходного вируса, и по этому результату рассчитывают нейтрализующую способность. Сегодня анализы на нейтрализующие антитела часто выполняются с помощью анализов уменьшения бляшек с большей точностью, но с несколько более сложными техническими требованиями.

Анализ нейтрализующих антител является специфичным и чувствительным, но трудоемким и трудоемким, поэтому он не используется широко в рутинных диагностических службах.

Тест ингибирования гемагглютинации

Многие вирусы связываются с молекулами гемагглютинина, обнаруженными на поверхности эритроцитов различных видов животных, и это может вызвать агрегацию эритроцитов в подходящих условиях. Предотвращение этой агрегации, называемое ингибированием гемагглютинации, с помощью специфических противовирусных антител в сыворотке больного широко используется в диагностических целях. Тест, известный как тест ингибирования гемагглютинации, имеет важные диагностические и медицинские применения при определенных инфекциях, особенно при гриппе, когда антитела, измеренные с помощью этого теста, демонстрируют дополнительную специфичность по сравнению с другими тестами и, следовательно, предоставляют более подробную информацию об иммунитете и перенесенных инфекциях. лица. Однако для диагностики отдельных пациентов этот метод больше не используется широко и заменяется более современными иммуноанализами.

В тесте вирусный препарат с заданной гемагглютинирующей способностью смешивают с образцом сыворотки и после соответствующей инкубации измеряют остаточную гемагглютинирующую способность. Антитела IgM и IgG способны ингибировать гемагглютинацию.

Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента (РСК) является классическим лабораторным диагностическим тестом, который до сих пор используется для определения вирусных антител в сыворотке пациентов или образцах спинномозговой жидкости при острой инфекции. Тест в основном измеряет антитела IgG.

Тест основан на способности комплемента, группы термолабильных белков, присутствующих в плазме большинства теплокровных животных, связываться с комплексами антиген-антитело. Когда комплексы присутствуют на поверхности эритроцитов, комплемент вызывает их лизис, который можно визуализировать с помощью подходящей экспериментальной установки.

В реальном тесте комплемент в сыворотке пациента сначала разрушается при нагревании; затем сыворотку смешивают с соответствующим вирусным антигеном и после инкубации; при образовании комплексов антиген-антитело добавляется экзогенный комплемент (обычно из свежей сыворотки морской свинки). Затем этот комплемент связывается с комплексами и, будучи «закрепленным», больше не может вызывать лизис добавленных индикаторных эритроцитов. Обычно бараньи эритроциты, покрытые антителами против овечьих эритроцитов, используются в качестве индикатора для измерения присутствия любого остаточного комплемента. Эффект измеряется соответствующим протоколом испытаний. Используют серийные разведения сыворотки пациента, и наивысшее разведение, при котором сыворотка еще может предотвратить активность комплемента в индикаторной системе, принимается за титр CFT образца. Тесты обычно проводят на титрационных микропланшетах, а результаты наблюдают визуально.

ЦФТ до сих пор используется для диагностики острой вирусной инфекции. Он измеряет определенные типы антител, которые появляются только во время острой фазы инфекции. Поэтому ЦФТ не подходит для исследования иммунного статуса. Процедура анализа довольно сложна, потому что тест зависит от нескольких биологических переменных, которые должны быть стандартизированы путем предварительного тестирования. Метод менее чувствителен, чем многие другие иммуноанализы. Кроме того, метод очень трудоемок и не поддается автоматизации. Использование CFT в диагностике вирусов все больше заменяется современными иммуноанализами.

Иммунологические анализы

В иммунологических анализах связывание антител со специфическими иммобилизованными антигенами можно непосредственно наблюдать с помощью связанных антигенов и соответствующих индикаторов, таких как меченые антитела против иммуноглобулина. Антигены могут быть иммобилизованы на пластиковых титрационных микропланшетах, предметных стеклах, фильтровальной бумаге или любом подобном материале. В настоящее время для измерения вирусспецифических антител IgM и IgG широко используются различные иммуноанализы. Самые современные форматы иммуноанализов позволяют одновременно обнаруживать как антигены, так и антитела, что значительно сокращает период окна между инфекцией и иммунным ответом. Доступны многочисленные коммерческие наборы с высокой специфичностью и чувствительностью. Благодаря автоматизации методы иммуноанализа стали более быстрыми, точными и простыми в применении.

В базовом формате твердофазных иммуноанализов инфицированные вирусом клетки, клеточные лизаты, очищенные или полуочищенные, рекомбинантные вирусные антигены или синтетические пептиды иммобилизуют на твердой фазе, обычно в пластиковых лунках для микротитрования или на предметных стеклах. Сыворотку пациента инкубируют с антигеном, и связанное антитело после этапов промывки визуализируют с использованием меченых антител против иммуноглобулина («конъюгата») ( ). Если используемая метка представляет собой фермент, тест называется иммуноферментным анализом (ИФА) или твердофазным иммуноферментным анализом (ИФА), и связанное антитело выявляют с помощью ферментозависимой цветной реакции. Если используется флуоресцентная метка, метод называется иммунофлуоресцентным тестом (ИФТ). Наиболее часто используемыми ферментными метками являются пероксидаза хрена (HRP) и щелочная фосфатаза (AP). В HRP-EIA цветообразующая система состоит из орто-фенилдиамина (OPD) в качестве хромогена и пероксидазы водорода (H ₂ O ₂ ) в качестве подложки. Если HRP-конъюгат связан с комплексами антитело-антиген, бесцветный хромоген становится желтым, и интенсивность окраски измеряется фотометром при длине волны 490–492 нм. Интенсивность окраски пропорциональна количеству связанного конъюгата и количеству специфических антител в образце сыворотки пациента. Если в сыворотке нет специфических антител, конъюгат не связывается и цветная реакция не возникает. Используя конъюгаты анти-IgG или анти-IgM, можно отдельно определить подклассы иммуноглобулинов.

Открыть в отдельном окне

Иммуноферментный анализ. (а) Обнаружение вирусспецифических антител. (b) Обнаружение вирусных антигенов.

Специфичность и чувствительность этих иммуноанализов высоки. Чувствительность может быть дополнительно улучшена за счет использования дополнительной стадии инкубации, когда IgM-антитела сначала обогащаются («захватываются») в образце с использованием анти-IgM-иммуноглобулина. Были разработаны модификации для повышения специфичности анализа с помощью различных методов обработки антигена и использования моноклональных антител или синтетических пептидов.

Иммунофлуоресцентные тесты использовались в прошлом для измерения вирусспецифических антител, но теперь они заменены методами ИФА. Принцип метода аналогичен ИФА. В IFT инфицированные клетки помещают на предметное стекло, и связанные антитела выявляют с помощью меченных флуоресцеином антител против иммуноглобулина. Предметные стекла исследуют под флуоресцентным микроскопом. Метод специфичен и чувствителен, но достаточно трудоемок, а чтение теста требует значительного опыта.

Иммуноблоттинг

При некоторых инфекциях (например, вызванных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ)) антитела к определенным компонентам вируса более информативны, чем другие менее специфичные антитела, и их выявляют с помощью иммуноблоттинга. Различные вирусные антигены, полученные с помощью гель-диффузии или других методов, абсорбируются в виде дискретных полос на сплошной полоске из целлюлозы или аналогичного материала, и полоска инкубируется с сывороткой пациента. Антитела, присутствующие в сыворотке, связываются со специфическими антигенами и выявляются с использованием конъюгата HRP и нитросинего тетразолия в качестве хромогена осаждающей окраски. Цветовую реакцию наблюдают и сравнивают с образцами положительного и отрицательного контроля, анализируемыми на отдельных полосках.

Тесты с латеральным потоком и латексом

Техника, известная как технология с латеральным потоком, также использовалась для идентификации антител или антигенов. Эти тесты включают нанесение сыворотки или других образцов непосредственно на полоску из подходящего материала, такого как целлюлоза, где антитела диффундируют латерально и в конечном итоге достигают места на полоске, где был нанесен и химически зафиксирован соответствующий антиген. Специфические антитела связываются с участком, в то время как нереагирующие антитела диффундируют из области. Наличие антител визуализируют с помощью меченых конъюгатов.

Хотя такие тесты не являются количественными, они полезны для инфекций, при которых показательно наличие специфических антител, таких как ВИЧ-инфекция. Выполнение теста часто очень простое, и результат можно получить через несколько минут или несколько часов, что делает такие тесты подходящими для скрининга у постели больного. В более продвинутых тестах несколько разных антител могут быть обнаружены с помощью одного анализа, а условия тестирования могут быть дополнительно изменены, чтобы можно было также обнаруживать антигены. Многие такие тесты стали коммерчески доступными в последние годы.

В некоторых случаях частицы латекса с покрытием заменили полоски с фиксированным антигеном в качестве твердой фазы. Связывание специфических антител можно визуализировать с помощью хромогенных или иным образом меченых индикаторных антител, либо положительную реакцию можно обнаружить по агглютинации частиц латекса.

Тесты в месте оказания медицинской помощи

Тесты в месте оказания медицинской помощи (POC-тесты) становятся все более распространенными в клинической практике. Большинство из них основаны на простой в использовании технологии латерального потока или латексных частиц и способны дать результат уже через несколько минут. В настоящее время тесты POC доступны для скрининга на антитела к растущему числу вирусных инфекций (ВИЧ, вирус гепатита С (HCV), вирус ветряной оспы (VZV), цитомегаловирус (CMV), вирус Эпштейна-Барр (EBV)). Некоторые авторитетные органы все еще сомневаются в пригодности POC-тестов для клинического использования, хотя есть убедительные доказательства того, что многие из имеющихся в продаже наборов дают надежные результаты.

Присутствие вирусных антигенов в клинических образцах, таких как аспираты из носоглотки, образцы кала, везикулярная жидкость, образцы тканей, а также образцы сыворотки, может быть продемонстрировано с помощью анализов обнаружения антигена.

В иммунофлуоресцентных тестах клетки из клинического образца фиксируют на предметном стекле, и вирусные антигены, присутствующие в клетках, выявляют с помощью меченных флуоресцеином вирусспецифических антител. Более надежные результаты можно получить с помощью иммуноферментного анализа или флюороиммуноанализа с временным разрешением (TR-FIA). В качестве конъюгата можно использовать меченные европием моноклональные антитела. Солюбилизированные антигены в клинических образцах сначала захватываются с помощью специфических моноклональных антител, связанных с твердой фазой, а затем выявляются с помощью меченных ферментом или европием вирус-специфических антител (4).

Методы обнаружения антигена особенно рекомендуются в случае реактивации вируса, например, для диагностики вирусов простого герпеса и ветряной оспы, когда серологический ответ может быть очень слабым. Анализы обнаружения антигена также широко используются при инфекциях дыхательных путей, таких как грипп и инфекции респираторно-синцитиального вируса. Также доступен простой тест для выявления антигенов ротавируса и аденовируса у детей с гастроэнтеритом.

Прямая демонстрация вирусных нуклеиновых кислот в клинических образцах все чаще используется для диагностики вирусов. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими праймерами можно быстро размножить и идентифицировать вирусные последовательности. Эти методы в значительной степени заменяют классическую изоляцию вирусов. Они выполняются быстро и во многих случаях более чувствительны, чем методы выделения вируса или обнаружения антигена, что делает возможной более раннюю диагностику. Они оказались особенно ценными для диагностики вирусов, которые нельзя культивировать, таких как папилломавирусы, парвовирусы и вирусы гепатита. Были разработаны полуколичественные и количественные приложения, позволяющие контролировать вирусную нагрузку во время противовирусного лечения. Эти тесты не могут отличить жизнеспособный вирус от вируса, неспособного к репликации, что требует осторожности при интерпретации результатов в некоторых случаях. Кроме того, чувствительность к перекрестному загрязнению в лаборатории вызвала некоторые проблемы в условиях клинической лаборатории.

Специфичность этих тестов основана на степени парного соответствия последовательностей между вирусными нуклеиновыми кислотами и праймерами. Чрезвычайно высокая чувствительность характерна для методов ПЦР; От 1 до 10 копий вирусной нуклеиновой кислоты можно обнаружить за несколько часов. Методы ПЦР доступны как для РНК-, так и для ДНК-вирусов. Для РНК-вирусов нуклеиновая кислота вируса должна быть транскрибирована с помощью фермента обратной транскриптазы (ОТ) в комплементарную ДНК (ОТ-ПЦР).

Вирусная нуклеиновая кислота извлекается из материала образца и амплифицируется в три последовательных этапа. Двухцепочечная ДНК сначала подвергается тепловой денатурации и разделяется на отдельные нити. Затем амплифицируется конкретный целевой фрагмент нити ДНК ( ) с помощью пар целевых олигонуклеотидных праймеров, каждый из которых гибридизуется с одной цепью двухцепочечной ДНК. Гибридизированные праймеры действуют как источник термостабильного фермента полимеразы, а комплементарная цепь синтезируется путем последовательного добавления дезоксирибонуклеотидов. После отжига праймеров начнется удлинение фрагмента ДНК. Эти циклы повторяются 35–40 раз, каждый цикл приводит к экспоненциальному увеличению количества копий.

Открыть в отдельном окне

Полимеразная цепная реакция.

После завершения амплификации продукты можно обнаружить несколькими методами. Электрофорез в агарозном геле в сочетании с окрашиванием продуктов бромистым этидием является классическим методом ( ). Размер амплифицированного продукта сравнивают с контрольными ампликонами и другими стандартами в том же геле. Различные гибридизационные анализы, основанные на меченых комплементарных олигонуклеотидах (зондах), также используются для повышения чувствительности и специфичности обнаружения.

Открыть в отдельном окне

Обнаружение продуктов ПЦР (ампликонов) электрофорезом в агарозном геле после окрашивания бромистым этидием.

Амплифицированные фрагменты также можно секвенировать, что дает дополнительную информацию о вирусе. Сравнение последовательностей с известными последовательностями вирусов позволяет идентифицировать виды, штаммы или подтипы, которые могут быть важны для общественного здравоохранения или медицинских целей. Секвенирование после ОТ-ПЦР в настоящее время также является предпочтительным методом исследования возникновения устойчивости к противовирусным препаратам у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Приборы для ПЦР в реальном времени отслеживают накопление ампликонов путем непрерывного измерения флуоресценции в каждом цикле реакции. Чем раньше продукт амплификации становится детектируемым на фоне, тем выше количество вируса в образце ( ). Одно приложение, основанное на использовании температур плавления, позволяет одновременно обнаруживать и анализировать несколько разных нуклеиновых кислот. Он также позволяет тестировать более одного вируса из одного и того же образца ( ).

Открыть в отдельном окне

Количественная ПЦР в реальном времени с флуоресцентно-мечеными зондами на парвовирус B19.

Открыть в отдельном окне

ОТ-ПЦР с обнаружением в реальном времени (а) и с анализом кривой плавления (б) для обнаружения респираторно-синцитиального вируса (РСВ), риновируса и энтеровируса в респираторных секретах (в). C _t — пороговый номер цикла, T _m — температура плавления, а NTC — контроль без шаблона. Неопубликованные результаты Варис М., Тевалуото Т. и Остербак Р.

Анализы ПЦР чрезвычайно чувствительны, и поэтому на них могут влиять ингибиторы фермента полимеразы, которые иногда присутствуют в клинических образцах. Внутренние контроли могут быть включены в реакционные смеси. Нуклеазы, присутствующие в образцах или реагентах, также могут вызывать ложноотрицательные результаты, разрушая вирусные нуклеиновые кислоты. Кроме того, ампликоны могут вызывать перенос продукта и ложноположительные результаты. При обращении с клиническими образцами, реагентами и продуктами реакции необходимо соблюдать особую осторожность.

Одним из больших преимуществ технологии ПЦР является ее способность обнаруживать новые появляющиеся вирусы. Используя праймеры родственных вирусов или так называемые общие праймеры, можно получить важную информацию о новом вирусе для дальнейшей разработки более специфических тестов. Хорошим примером является вирус тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС), специальные диагностические тесты для которого стали доступны вскоре после того, как стало известно таксономическое положение вируса. Эта технология также обеспечивает безопасное обращение с образцами вируса и их транспортировку, поскольку буферы для экстракции, добавленные к образцам, инактивируют инфекционность вируса.

В интересах общественного здравоохранения, научных и коммерческих интересов постоянно разрабатываются новые диагностические тесты для лабораторной диагностики вирусных инфекций. Основной областью развития, вероятно, будут новые методы молекулярного обнаружения, где автоматизация обеспечит быструю, хорошо стандартизированную и простую в использовании технологию.

Использование мультианалитных методов становится практической реальностью, и в будущем они могут существенно изменить диагностику инфекционных заболеваний. Они дают возможность одновременно проводить скрининг на широкий спектр вирусов, увеличивая скорость диагностической процедуры. Один тест-микрочип (микрочип) может содержать тысячи вирус-специфических олигонуклеотидных зондов, нанесенных на предметное стекло. Уже существует несколько наборов для обнаружения вирусных нуклеиновых кислот и антигенов или вирус-специфических антител. Микрочипы, основанные на случайной ПЦР-амплификации, могут быть использованы для обнаружения множества вирусов, принадлежащих к разным семействам. Скрининг некоторых других маркеров инфекции также может быть включен в тот же формат теста. Микрочипы не получили широкого применения в клинических целях из-за ограниченной чувствительности и сложности разработки аналитических инструментов, подходящих для диагностических лабораторий. Еще одним направлением развития является увеличение числа POC-тестов, которые могут стать важной частью будущего диагностического тестирования инфекционных заболеваний.

Антигенность и иммуногенность вирусных белков; Диагностические методы: микрочипы; Иммунный ответ на вирусы: иммунитет, опосредованный антителами

• Халонен П., Меурман О., Лёвгрен Т. Обнаружение вирусных антигенов с помощью флюороиммуноанализа с временным разрешением. В: Купер М., редактор. об. 104. Спрингер; Гейдельберг: 1983. стр. 133–146. (Актуальные темы микробиологии и иммунологии). [PubMed] [Google Scholar]
• Хедман К., Лаппалайнен М., Седерлунд М., Хедман Л. Авидность IgG в серодиагностике инфекционных заболеваний. Обзор медицинской микробиологии. 1993;4:123–129. [Google Scholar]
• Хукканен В., Вуоринен Т. Вирусы герпеса и энтеровирусы при инфекциях центральной нервной системы: исследование с использованием флюорометрии с временным разрешением ПЦР. Журнал клинической вирусологии. 2002; 25:S87–S94. [PubMed] [Google Scholar]
• Джеффри К., Пиллэй Д. Диагностические подходы. В: Цукерман А., редактор. Принцип и практика клинической вирусологии. Уайли; Чичестер, Великобритания: 2004. стр. 1–21. [Google Scholar]
• Ван Д., Коской Л., Зилберберг М. Обнаружение и генотипирование вирусных патогенов на основе микрочипов. Труды Национальной академии наук США. 2002;99:15687–15692. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

EIA

Иммуноферментные анализы — это методы, используемые для оценки вирусспецифических антител IgG и IgM или вирусных антигенов с помощью конъюгатов, меченных ферментами.

ПКР

С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и специальных праймеров можно размножать последовательности ДНК.

ОТ-ПЦР

Для РНК нуклеиновая кислота должна быть транскрибирована с помощью фермента обратной транскриптазы (RT) в комплементарную ДНК перед ПЦР.

Серология: цель, результаты и последующее лечение

Что такое серологические тесты?

Серологические тесты — это анализы крови, которые ищут антитела в крови. Они могут включать ряд лабораторных методов. Различные типы серологических тестов используются для диагностики различных болезненных состояний.

Серологические тесты имеют одну общую черту. Все они сосредоточены на белках, вырабатываемых вашей иммунной системой. Эта жизненно важная система организма помогает поддерживать ваше здоровье, уничтожая чужеродных захватчиков, которые могут вызвать у вас заболевание. Процесс проведения теста одинаков, независимо от того, какой метод лаборатория использует во время серологического тестирования.

Полезно немного узнать об иммунной системе и о том, почему мы заболеваем, чтобы понять серологические тесты и почему они полезны.

Антигены – это вещества, вызывающие реакцию иммунной системы. Обычно они слишком малы, чтобы увидеть их невооруженным глазом. Они могут попасть в организм человека через рот, через поврежденную кожу или через носовые ходы. Антигены, которые обычно поражают людей, включают следующие:

• бактерии
• грибы
• вирусы
• паразиты

Иммунная система защищает от антигенов, вырабатывая антитела. Эти антитела представляют собой частицы, которые прикрепляются к антигенам и деактивируют их. Когда ваш врач исследует вашу кровь, он может определить тип антител и антигенов, которые находятся в вашем образце крови, и определить тип вашей инфекции.

Иногда организм ошибочно принимает собственные здоровые ткани за внешние захватчики и вырабатывает ненужные антитела. Это известно как аутоиммунное заболевание. Серологическое тестирование может обнаружить эти антитела и помочь вашему врачу диагностировать аутоиммунное заболевание.

Образец крови — это все, что нужно лаборатории для проведения серологического исследования.

Тест будет проводиться в кабинете вашего врача. Ваш врач введет иглу в вашу вену и возьмет кровь для образца. Врач может просто проколоть кожу ланцетом, если проводит серологическое исследование маленького ребенка.

Процедура тестирования быстрая. Уровень боли для большинства людей не является сильным. Могут возникнуть чрезмерное кровотечение и инфекция, но риск любого из них низок.

Антитела разнообразны. Итак, существуют различные тесты для выявления наличия разных типов антител. К ним относятся:

• Анализ агглютинации показывает, вызывают ли антитела, контактирующие с определенными антигенами, слипание частиц.
• Тест на преципитацию показывает сходство антигенов путем измерения присутствия антител в жидкостях организма.
• Вестерн-блоттинг определяет наличие антимикробных антител в крови по их реакции с антигенами-мишенями.

Нормальные результаты анализов

Ваш организм вырабатывает антитела в ответ на антигены. Если анализ не показывает антител, это означает, что у вас нет инфекции. Результаты, показывающие отсутствие антител в образце крови, являются нормальными.

Аномальные результаты анализов

Антитела в образце крови часто означают, что у вас была реакция иммунной системы на антиген в результате текущего или прошлого контакта с болезнью или чужеродным белком.

Тестирование также может помочь вашему врачу диагностировать аутоиммунное заболевание, выяснив, присутствуют ли в крови антитела к нормальным или нечужеродным белкам или антигенам.

Наличие определенных типов антител также может означать, что вы невосприимчивы к одному или нескольким антигенам. Это означает, что дальнейшее воздействие антигена или антигенов не приведет к заболеванию.

Серологический анализ позволяет диагностировать множество заболеваний, в том числе:

• бруцеллез, вызываемый бактериями
• амебиаз, вызываемый паразитом
• корь, вызываемый вирусом
вирус
• ВИЧ
• сифилис
• грибковые инфекции

Уход и лечение после серологического исследования могут различаться. Часто это зависит от того, были ли обнаружены антитела. Это также может зависеть от характера вашего иммунного ответа и его тяжести.

Антибиотик или другой тип лекарства может помочь вашему организму бороться с инфекцией. Даже если ваши результаты были нормальными, ваш врач может назначить дополнительный тест, если он все еще считает, что у вас может быть инфекция.

Бактерии, вирусы, паразиты или грибки в вашем теле со временем будут размножаться.