Российские химики создали самый маленький флуороген-активирующий белок
Российские ученые изучили структуру одного флуороген-активирующего белка, который активно применяют как инструмент для биомолекулярных исследований, и нашли способ его уменьшить. В результате авторы получили самый маленький в мире флуороген-активирующий белок, что делает его еще более удобным в использовании. Работа опубликована в Chemical Science.
Флуоресцентные метки часто используются в биологии для изучения структуры клеток, а также биологических процессов на клеточном уровне. Большое количество таких меток — флуорецсентные белки. Ученые вносят в клетки гены этих белков, и сами клетки начинают производить необходимые метки по предоставленной инструкции. Иногда применяются и химические метки из малых молекул (красок), которые флуоресцируют в ответ на связывание с чем-либо или в результате химической реакции. Однако и у тех, и других есть свои ограничения в использовании — флуоресцентные белки достаточно большие, и им требуется время на созревание в присутствии кислорода, а краски нередко помечают не только целевые объекты.
С этой точки зрения обещающими инструментами выглядят флуорогены: вещества (краски) с очень слабой флуоресценцией в свободном состоянии, которые становятся очень яркими, как только связываются с еще одним компонентом, например, активирующим флуороген белком. Таким меткам не нужен кислород для созревания, и их можно использовать для исследований в анаэробных условиях. Флуоресцентным сигналом этих меток можно управлять, добавляя или смывая сам флуороген. Еще одна важная характеристика — размер: чем метка меньше, тем меньше она влияет на природную динамику исследуемой системы. Флуороген-активирующие белки, как правило, в два раза меньше флуорецсентных белков.
Один из таких активирующих белков был разработан на основе бактериального фоторецептора. Замена нескольких аминокислотных остатков позволила его использовать как активатор для группы флуорогенов. Однако структура этого белка оставалась неизвестной.
Ученые из Института биоорганической химии РАН под руководством Михаила Баранова при помощи ЯМР-спектроскопии изучили структуру этого белка в свободной форме и в комплексе с краской-флуорогеном.
Исследователи заметили, что часть белка на его N-конце не имеет четкой структуры в свободном состоянии и меняет форму, только когда с белком связывается краска. Ученые предложили, что поскольку процесс связывания флуорогена начинается еще до изменения структуры N-конца, то, возможно, активировать флуорецсенцию краски белок может и без этой части.
Авторы укоротили молекулу на 26 аминокислотных остатков. «Карман» для связывания краски увеличился, и белок не смог активировать ранее описанные в литературе флуорогены. Тогда исследователи составили библиотеку новых вариантов красок и выбрали ту, которая подошла к укороченному белку. Таким образом, ученые создали самый маленький в мире функциональный флуороген-активирующий белок, состоящий всего из 98 аминокислотных остатков. Флуоресценция краски после связывания с новым белком увеличивается больше чем в 100 раз, квантовый выход составляет 55 процентов, а константа связывания близка к 1 микромолю — по всем этим параметрам белок похож на своего предшественника.
Авторы работы также показали новый белок в работе: трансфицировали им клетки, при этом к белку добавили последовательности, заставляющие его локализоваться на той или иной структуре в клетке. Возникающая при добавлении флуорогена локальная флуоресценция позволяет визуализировать строение клетки.
Фото: Konstantin S. Mineev et al. / Chemical Science, 2021
Оральный контрацептив для серой белки. Как маленький зверек стал чумой британских лесов
Подпишитесь на нашу рассылку ”Контекст”: она поможет вам разобраться в событиях.
Автор фото, BBC/Tony Jolliffe
Подпись к фото,Серые белки гораздо крупнее рыжих. Их жизнедеятельность оказалась губительной для целых экосистем
Ученые в Британии говорят, что скоро начнут полевые испытания системы по контролю над популяцией серых белок. Система разработана по заказу правительства. Белкам готовят оральные контрацептивы.
Предполагается заманивать серых белок в специальные кормушки, где их будет ждать паста из фундука с подмешанным в нее препаратом.
Кормушки разработаны таким образом, что никакое другое животное или птица не смогут туда попасть, уверяют биологи.
Контрацептив, которым будет пропитана еда в кормушках, влияет на репродуктивную функцию как самок, так и самцов.
Необходимость жесткого контроля над рождаемостью серых белок назрела, когда их численность в Великобритании превысила 2,5 млн особей и стала разрушительно влиять на местные экосистемы, поставив на грань исчезновения популяцию рыжих белок.
По словам заместителя министра охраны окружающей среды лорда Беньона, правительство и ученые искали гуманный способ сокращения численности этих животных, и предлагаемый проект — самый оптимальный вариант.
Быстро плодятся и сильно вредят
Серые белки были завезены в Великобританию из Северной Америки в XIX веке.
И теперь уже ясно, что они наносят непоправимый ущерб лесным массивам, сдирая кору с молодых деревьев. Особенно страдают дубы, буки, каштаны и платаны.
Большинство таких деревьев в конечном итоге погибает.
Автор фото, BBC/Tony Jolliffe
Подпись к фото,Рыжие белки — коренные обитатели британских островов, но их существование оказалось под угрозой, виноваты серые белки
Британское правительство взяло на себя обязательство посадить десятки тысяч гектаров молодого леса. Но финансовый урон от серых белок достигает 37 млн фунтов стерлингов в год только лишь в Англии и Уэльсе.
Кроме того, их популяция поставила на грань исчезновения их рыжих сородичей.
По последним данным, в Британии на сегодняшний день насчитывается всего примерно 160 тысяч рыжих (другое название — красных) белок, и из них лишь 15 тыс. обитают в Англии.
- Какие животные могут скоро исчезнуть с лица земли
- Хищные растения в Англии исчезают. Их попытаются возродить
- Гигантские мыши с острова Гоф уничтожают тристанских альбатросов.
За это их убьют - «Сразу убивайте». В США расплодились змееголовы с Дальнего Востока
За это их убьютСерые белки значительно крупнее и сильнее рыжих и являются переносчиками вируса оспы белок, к которому сами невосприимчивы, а для рыжих белок этот вирус смертелен.
Традиционно контроль над популяцией серых белок осуществлялся посредством так называемой выбраковки — ликвидацией потомства, не соответствующего стандартам вида.
Этот метод использовался около 100 лет, но в последнее время репродуктивность серых белок достигла небывалых масштабов.
Маленьким вход запрещен
Доза противозачаточного средства — куда более гуманная и более эффективная альтернатива, считает ведущий научный сотрудник проекта доктор Джованна Массей из государственного Агентства по защите здоровья животных и растений (APHA).
Она объясняет, что ее коллектив разработал вакцину, которая побуждает иммунную систему ограничивать выработку половых гормонов.
Сейчас ученые заняты поиском оптимальной дозы, которая могла бы обеспечить длительный эффект и при этом была бы безопасной для использования в дикой природе.
Первые испытания, проведенные в Йоркшире и Уэльсе, показали, что за четыре дня эксперимента кормушки посетили порядка 70% белок в каждом лесу.
Автор фото, BBC/Tony Jolliffe
Подпись к фото,Сложность создания такой кормушки в том, чтобы исключить проникновение в нее любых других животных (экспериментальный вариант)
Кормушки снабжены утяжеленной дверцей, которую, по идее, не под силу открыть любому другому животному. Всего однажды внутрь попали две мыши, но, по словам ученых, это было стечение обстоятельств.
В тех районах, где рыжие белки обитают вместе с серыми, кормушки будут оснащены специальной пластиной на входе, которая будет определять вес животного и запускать механизм, открывающий дверцу только для более тяжелых особей.
По словам Джованны Массей, новым методом можно добиться полного исчезновения популяции серых белок в отдельно взятых районах, если на то будет рекомендация экологов.
За экспериментами британских коллег внимательно следят специалисты из других стран и других областей зоологии. Если опыт с серыми белками окажется успешным, аналогичные методы можно будет использовать для контроля над популяциями других инвазивных (агрессивных) видов млекопитающих, включая крыс, мышей, оленей и кабанов.
Автор фото, BBC/Tony Jolliffe
Подпись к фото,Оральные контрацептивы — гуманный способ контроля над популяцией серых белок, считают ученые
Чтобы продолжать получать новости Би-би-си, подпишитесь на наши каналы:
- Telegram
- VK
- OK
Загрузите наше приложение:
- iOS
- Android
» Насколько велик «средний» белок?
Рисунок 1: Галерея белков.
Репрезентативные примеры размера белка показаны с примерами, нарисованными для иллюстрации некоторых ключевых функциональных ролей, которые они берут на себя. Все белки на рисунке показаны в одном масштабе, чтобы создать представление об их относительных размерах. Маленькие красные объекты, показанные на некоторых молекулах, являются субстратами для интересующего белка. Например, в гексокиназе субстратом является глюкоза. Известно, что ручка в АТФ-синтазе существует, но точная структура недоступна и поэтому нарисована только схематически. Имена в скобках — это идентификаторы записей структур базы данных PDB. (Рисунок предоставлен Дэвидом Гудселлом).
Белки часто называют рабочими лошадками клетки. Впечатление об относительных размерах этих различных молекулярных машин можно получить из галереи, показанной на рис. воздуха. Эта молекула, один из самых распространенных белков на Земле, ежегодно извлекает из атмосферы около сотни гигатонн углерода. Это примерно в 10 раз больше, чем все выбросы углекислого газа, производимые человечеством из выхлопных труб автомобилей, реактивных двигателей, электростанций и всех других наших технологий, работающих на ископаемом топливе.
Рисунок 2: Галерея гомоолигомеров, демонстрирующая прекрасную симметрию этих общих белковых комплексов. Розовым цветом выделены мономерные субъединицы, составляющие каждый олигомер. Рисунок Дэвида Гудселла.
Размер белков, таких как Rubisco, АТФ-синтаза и многих других, может быть измерен как геометрически с точки зрения того, сколько места они занимают, так и с точки зрения размера их последовательности, определяемой количеством аминокислот, которые связаны друг с другом, чтобы образовать белок. Учитывая, что молекулярная масса средней аминокислоты составляет 100 Да, мы можем легко преобразовать массу в длину последовательности. Например, мономер Rubisco массой 55 кДа содержит примерно 500 аминокислот, составляющих его полипептидную цепь. Пространственная протяженность растворимых белков и размер их последовательности часто демонстрируют приблизительное свойство масштабирования, когда объем масштабируется линейно с размером последовательности, и, таким образом, радиусы или диаметры имеют тенденцию масштабироваться по мере увеличения последовательности в степени 1/3.
Существует часто удивительная разница в размерах между ферментом и субстратом, на котором он работает. Например, в метаболических путях субстратами являются метаболиты, которые обычно имеют массу менее 500 Да, в то время как соответствующие ферменты обычно примерно в 100 раз тяжелее. В пути гликолиза небольшие молекулы сахара обрабатываются для извлечения энергии и строительных блоков для дальнейшего биосинтеза.
Этот путь характеризуется множеством белковых машин, каждая из которых намного больше, чем их сахарные субстраты, с примерами, показанными в правом нижнем углу рисунка 1, где мы видим относительный размер субстратов, обозначенных красным, при взаимодействии с их ферментами. .
Рисунок 3: Распределение длины белков в E. coli, почкующихся дрожжах и клетках HeLa человека. (A) Длина белка рассчитывается в аминокислотах (АА) на основе кодирующих последовательностей в геноме. (B) Распределения строятся после взвешивания каждого гена с числом копий белка, полученным из масс-спектрометрических протеомных исследований (M. Heinemann в печати, M9+глюкоза; LMF de Godoy et al. Nature 455:1251, 2008, определенная среда; T. Гейгер и др., Mol. Cell Proteomics 11:M111.014050, 2012). Сплошные линии представляют собой гауссовские оценки ядерной плотности для распределений, служащие ориентиром для глаз.
Таблица 1: Средняя длина кодирующих последовательностей белков на основе геномов разных видов.
Записи в этой таблице основаны на биоинформатическом анализе L. Brocchieri и S. Karlin, Nuc. Кислоты. Res., 33:3390, 2005, BNID 106444. Как обсуждается в тексте, мы предлагаем альтернативную метрику, которая взвешивает белки по их количеству, как показано в недавних масс-спектральных переписях всего протеома. Результаты не сильно отличаются от записей в этой таблице: эукариоты в среднем имеют длину около 400 аминокислотных остатков, а бактерии — около 300 аминокислотных остатков.
Конкретные значения средней длины гена можно рассчитать на основе последовательностей генома в качестве биоинформатического упражнения. В таблице 1 приведены эти значения для различных организмов, демонстрирующих тенденцию к более длинным последовательностям, кодирующим белок, при переходе от одноклеточных к многоклеточным организмам. На рисунке 3 мы выходим за рамки средних размеров белков, чтобы охарактеризовать полное распределение длин кодирующих последовательностей в геноме, сообщая значения для трех модельных организмов.
о. и у эукариот ≈400 а.о. Распределения на рисунке 3 показывают, что это разумная оценка, хотя в некоторых случаях она может быть завышенной.Одна из прелестей биологии заключается в том, что эволюция требует очень разнообразных функциональных элементов, создающих выбросы почти в любом свойстве (это также причина, по которой мы обсуждали медианы, а не средние значения выше). Когда дело доходит до размера белка, тайтин является огромным исключением. Титин является многофункциональным белком, который ведет себя как нелинейная пружина в мышцах человека, его многочисленные домены разворачиваются и перестраиваются под действием сил и придают мышцам эластичность. Титин примерно в 100 раз длиннее среднего белка с его полипептидной цепью из 33 423 а.о. (BNID 101653). Идентификация самых маленьких белков в геноме все еще остается спорной, но короткие рибосомные белки размером около 100 а.о. обычны.
Очень часто используется маркировка белков GFP для изучения всего, от их локализации до их взаимодействий.
Вооружившись знанием характерного размера белка, мы теперь готовы вернуться к, казалось бы, безобидному процессу мечения белка. GFP имеет длину 238 аминокислот и состоит из бета-ствола, внутри которого ключевые аминокислоты образуют флуоресцентный хромофор, как обсуждается в виньетке «Каково время созревания флуоресцентных белков?». В результате для многих белков процесс мечения действительно следует рассматривать как создание белкового комплекса, который теперь в два раза больше исходного неповрежденного белка.
212226 Всего просмотров 80 просмотров сегодня
Крошечные белки с большими функциями – Yale Scientific Magazine
Из чего состоит белок? Поначалу ответ кажется простым любому, кто знаком с основами биологии. Аминокислоты, небольшие органические соединения, соединяются в цепочки, которые складываются в уникальные трехмерные структуры, которые мы называем белками.
Размер имеет значение в протеомике или научном изучении белков. Эти молекулы обычно сложны и состоят из сотен, если не тысяч аминокислот. Белок с доказанной биологической функцией обычно содержит не менее 300 аминокислот. Но результаты недавнего исследования, проведенного в Йельской школе медицины, ставят под сомнение представление о том, что белки должны иметь длинные цепи, чтобы выполнять биологические функции. То есть малый размер не может быть конечной целью для белков.
Недавнее исследование возглавил лабораторию профессора генетики Йельского университета Дэниела ДиМайо. Первый автор Эрин Хейм, аспирант лаборатории, и ее коллеги провели генетический скрининг, чтобы выделить набор функциональных белков с самым минимальным набором аминокислот из когда-либо описанных. Цепочки короткие и простые, и тем не менее они влияют на рост клеток и образование опухолей. Мало кто из ученых мог предположить, что такие простые молекулы могут иметь такое огромное значение для онкологии и для нашего понимания белков и аминокислот.
Разработка простейших белков в мире
Существует 20 часто упоминаемых аминокислот, и их последовательность в цепочке определяет структуру и функцию полученного белка. Большинство белков состоят из множества различных аминокислот. Напротив, белки, идентифицированные в этом исследовании, названные белками LIL, полностью состоят из двух аминокислот: лейцина и изолейцина.
Обе эти аминокислоты гидрофобны, то есть боятся воды. Ученые из лаборатории ДиМайо целенаправленно искали гидрофобные свойства белков. Полностью гидрофобный белок ограничен тем, где он может располагаться внутри клетки и какие формы он может принимать. Чтобы поддерживать безопасное расстояние от воды, гидрофобный белок должен располагаться внутри клеточной мембраны, защищенный с обеих сторон одинаково боящимися воды молекулами, называемыми липидами.
Кроме того, гидрофобное свойство снижает сложность белка, ограничивая возможность взаимодействия между полярными боковыми цепями гидрофильных или водолюбивых аминокислот. Эти полярные боковые цепи склонны к перетасовке электронов и другим модификациям, что значительно усложняет функцию и динамику белка.
Хейм и ее группа хотели, чтобы все было просто: полностью гидрофобный белок более предсказуем, и поэтому его легче исследовать в качестве исследовательского центра. «Редко бывает, что белок полностью состоит из гидрофобных аминокислот», — сказал Росс Федерман, еще один аспирант лаборатории ДиМайо и еще один автор недавней статьи.
Белки LIL были редкими и невероятно ценными. «[Использование этих белков] устраняет большую часть осложнений, зная, где они находятся и как они выглядят», — сказал Хейм. С точки зрения как химической реактивности, так и аминокислотного состава, она сказала, что белки LIL действительно проще всего сконструировать для выполнения биологической функции.
Маленькие белки, большие функции
Какова была последующая биологическая функция? Благодаря своим исследованиям ученые смогли связать свои крошечные белки LIL с ростом, пролиферацией и раком клеток.
Команда начала с библиотеки из более чем трех миллионов случайных последовательностей LIL и включила их в ретровирусы, или вирусы, которые заражают, встраивая свою вирусную ДНК в ДНК клетки-хозяина. «По сути, мы манипулируем вирусами, чтобы делать нашу грязную работу», — сказал Хейм. «Один или два вируса проникнут в каждую клетку, интегрируются в клеточную ДНК, и клетка выработает этот белок».
Поскольку клетки со встроенной вирусной ДНК начали производить различные белки, исследователи наблюдали за их биологическими функциями. В конце концов, они обнаружили в общей сложности 11 функциональных белков LIL, каждый из которых способен активировать рост клеток.
Конечно, это звучит хорошо, но неконтролируемый рост клеток может привести к пролиферации раковых клеток и опухолей.
Белки LIL в этом исследовании влияли на рост клеток, взаимодействуя с рецептором тромбоцитарного фактора роста бета, или PDGFβ. Этот белок участвует в процессах пролиферации, созревания и движения клеток. Когда мутирует ген рецептора PDGFβ, участие белка в росте клеток нарушается, что приводит к неконтролируемой репликации и образованию опухолей. Активируя рецептор PDGFβ, белки LIL в этом исследовании обеспечивают клеткам независимость от фактора роста, что означает, что они могут свободно размножаться и потенциально могут трансформироваться в раковые клетки.
В то время как в этом конкретном исследовании были разработаны белки, которые активировали PDGFβ, Хейм сказал, что другая работа в лаборатории превратила аналогичные белки в ингибиторы рецептора, вызывающего рак. Обнаружив белки, блокирующие активацию PDGFβ, можно будет разработать новый метод против одного источника рака. Несмотря на то, что биологическая функция в их последней статье была злокачественной, Хейм и ее группа надеются, что эти крошечные белки LIL также могут быть применены для решения проблем в генетике.
Переоценка восприятия белка
Известно, что не существует другого белка с такими простыми последовательностями, как в молекулах LIL. Были обнаружены и другие мини-белки, но ни один из них не проявлял биологической активности. Например, Trp-cage ранее был идентифицирован как самый маленький из существующих мини-белков, известный своей способностью спонтанно складываться в глобулярную структуру. Эксперименты с этой молекулой были разработаны для улучшения понимания динамики сворачивания белка. Хотя Trp-клетки и подобные мини-белки служат важной цели в исследованиях, они не соответствуют белкам LIL в биологическом функционировании.
Недавнее исследование в лаборатории DiMaio преследовало вопрос, выходящий за рамки фундаментальной, концептуальной науки: команда изучала биологическую функцию малых белков, а не только их физические характеристики.
Открытие молекул LIL и роли, которую они могут играть, имеет большое значение для того, как ученые думают о белках.
В протеомике исследователи обычно не ожидают найти белки с необычайно короткими или простыми последовательностями. По этой причине эти последовательности, как правило, упускают из виду или игнорируют при сканировании генома. «Эта статья показывает, что и [короткие, и простые белки] могут быть действительно важны, поэтому, когда кто-то сканирует геном и исключает все эти возможности, он многое теряет», — сказал Хейм.
Кроме того, ограничив разнообразие аминокислот в этих белках, исследователи смогли лучше понять основные механизмы изменения аминокислот. «Если вы хотите проникнуть в суть какого-то механизма, чем больше вы сможете изолировать переменные, тем лучше будут ваши результаты», — сказал Федерман.
Особенно это касается белков. Эти молекулы очень сложны, обладают различной энергетической стабильностью, различными конформациями и потенциальными существенными различиями в аминокислотной последовательности. Изучая белки LIL, исследователи из лаборатории DiMaio смогли изолировать эффекты изменений конкретных аминокислот на молекулярном уровне.
Это важная информация для белковых инженеров, которые склонны одинаково относиться к большинству гидрофобных аминокислот. Это исследование противоречило этому представлению: «Лейцин и изолейцин имеют очень разные действия», — сказал Хейм. «Даже когда две аминокислоты выглядят одинаково, на самом деле они могут иметь очень разную биологию».
Другой текущий проект в лаборатории включает скрининг ранее существовавших баз данных рака в поисках белков с короткой последовательностью. По словам Хайма, вполне возможно, что ученые в конечном итоге обнаружат естественные виды рака, содержащие структуру, аналогичную белкам LIL, выделенным в этом исследовании. Это продолжающееся исследование будет способствовать дальнейшему выяснению канцерогенного потенциала крошечных молекул LIL.
Чтобы вывести свою недавнюю работу на новый уровень, исследователи этой группы стремятся создать белки с функциями, которые не возникли в результате эволюции. Возможность создавать белки с совершенно новыми функциями — захватывающая и многообещающая перспектива.