Посев на флору с определением чувствительности к антибиотикам норма: Посев на флору с определением чувствительности к антибиотикам: исследования в лаборатории KDLmed

Содержание

Посев на флору с определением чувствительности к антибиотикам: исследования в лаборатории KDLmed

Это микробиологическое исследование, позволяющее определить качественный и количественный состав микрофлоры исследуемого биоматериала, в том числе выявить условно-патогенные микроорганизмы в высоком титре и патогенные микроорганизмы, определить их чувствительность к антибиотикам.

При обнаружении микробиологическим методом микроорганизмов, составляющих нормальную микрофлору, или условно-патогенных микроорганизмов в титре менее диагностического не определяется чувствительность к антибиотикам и бактериофагам, так как это количество не является значимым и не требует лечения противомикробными препаратами.

Исследуется аэробная микрофлора.

Синонимы русские

Бактериологический посев на флору с определением чувствительности к антибиотикам.

Синонимы английские

Culture, routine. Bacteria identification and antibiotic susceptibility testing.

Метод исследования

Микробиологический метод.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Разовую порцию мочи, урогенитальный мазок (с секретом предстательной железы), мокроту, мазок из ротоглотки, грудное молоко, мазок из носоглотки, эякулят, отделяемое уха, мазок с конъюнктивы, мазок из носа, синовиальную жидкость, мазок из цервикального канала, мазок из уретры, отделяемое абсцесса полости рта, плевральную жидкость, ликвор, смыв из бронхов, желчь, экссудат, биоптат, содержимое желчного пузыря.

Как правильно подготовиться к исследованию?

  • Рекомендуется употребить большой объём воды за 8-12 часов до сбора мокроты.
  • Исключить приём мочегонных препаратов в течение 48 часов до сбора мочи (по согласованию с врачом).
  • Женщинам рекомендуется сдавать урогенитальный мазок или мочу до менструации или через 2 дня после её окончания.
  • Мужчинам не следует мочиться в течение 3 часов до сдачи урогенитального мазка или мочи.
  • Не чистить зубы в день взятия биоматериала на исследование.

Общая информация об исследовании

Нормальная микрофлора человека представляет собой совокупность микроорганизмов, населяющих кожу и слизистые оболочки. Наибольшее их количество (около 40 %) обитает в желудочно-кишечном тракте, остальная часть – на кожных покровах, зеве, глотке, в мочеполовой системе и др. Нормальная микрофлора подразделяется на постоянную (составляет до 90 % присутствующих в организме микробов), факультативную (менее 10 %) и случайную (не более 0,5 %).

По способности вызывать инфекционные заболевания микроорганизмы классифицируют на непатогенные (не вызывающие заболевания), условно-патогенные (в норме могут выделяться в небольших количествах и при определённых условиях активно размножаются, приводя к воспалению) и патогенные (являются возбудителями инфекционных заболеваний и в составе нормальной микрофлоры не обнаруживаются).

Бактериологическое исследование (посев на флору) позволяет определить качественный и количественный состав микрофлоры исследуемого клинического материала, в том числе выявить патогенные микроорганизмы. При обнаружении условно-патогенных микроорганизмов в высоком титре или патогенных микроорганизмов определяется их чувствительность к антибиотикам и бактериофагам.

Для чего используется исследование?

  • Чтобы установить возбудителя инфекционного заболевания.
  • Для подбора рациональной антимикробной терапии.
  • Чтобы оценить эффективность проводимой терапии.

Когда назначается исследование?

При воспалительных заболеваниях различных локализаций (за исключением воспалительных заболеваний кишечника).

Что означают результаты?

Референсные значения для различных видов микроорганизмов зависят от их локализации (точки взятия биологического материала).

Что может влиять на результат?

Предшествующая противогрибковая или антибактериальная терапия.

Также рекомендуется

Кто назначает исследование?

Терапевт, врач общей практики, педиатр, хирург, ЛОР, пульмонолог, уролог, гинеколог, дерматовенеролог, офтальмолог.

Литература

  • Chernecky С.С. Laboratory tests and diagnostic procedures /  С.С. Chernecky, B.J. Berger ; 5th ed. – St Louis : Saunders Elsevier, 2008. – 1232 p.
  • Gill V.J., Fedorko D.P., Witebsky F.G. The clinician and the microbiology laboratory. In: Principles and practice of infectious disease / G.L. Mandell, Bennett J.E., R. Dolin (Eds) ; 6th ed. – Churchill Livingstone, Philadelphia, PA 2005. – 2701 p.
  • Levinson W. Medical microbiology and immunology: examination and board review (Lange medical books series) / W. Levinson ; 8th ed. – NY : McGraw-Hill, 2004. – 654 p.

Посев из влагалища чувствительность к антибиотикам

Посев на микрофлору из влагалища с определением чувствительности к антибиотикам

Бактериальный посев микрофлоры влагалища – это определение состава микроорганизмов, населяющих половые органы женщины. Выяснение бактериальной флоры является залогом успешной антибиотикотерапии.

Подготовка к исследованию:

  • Не рекомендуется сдавать материал во время приема антибактериальных препаратов, во время менструации
  • За 2-3 дня до сдачи материала следует прекратить местное лечение (кремы, мази, свечи)
  • В день сдачи материала не рекомендуется подмываться
  • За 1,5-2 часа до сдачи следует воздержаться от мочеиспускания

Тип биоматериала: Влагалищное отделяемое, мазок

Синонимы (rus): Бактериальный посев, посев на флору, посев на определение чувствительности флоры к антибиотикам

Синонимы (eng): Genitourinary tract Culture, Bacteria Identification and Antibiotic Susceptibility testing

Методы исследования: микробиологический

Единицы измерения: КОЕ/мл, возведенное в степень

Сроки выполнения: 3-5 дней

Что такое посев на влагалищную микрофлору?

В норме у половозрелой женщины облигатная влагалищная микрофлора находится в количественном и качественном равновесии, не позволяя патогенной флоре развиваться на женских половых органах. Биоценоз влагалища представлен анаэробными бактериями, в их число входят:

  • Грамположительные облигатные бактерии – лактобациллы, клостридии, бифидобактерии.
  • Грамотрицательные микроорганизы – вейлонеллы, бактероиды, фузобактерии.
  • Факультативные бактерии – гарднереллы, стафилококки/стрептококки, кандидобактерии, микоплазма.

В норме в женском влагалище присутствует около 45 видов микроорганизмов, а их общее количество составляет 107-109 колониеобразующих единиц в миллилитре (КОЕ/мл). Большую часть влагалищной флоры составляют лактобактерии. Снижение их количества влечет за собой рост условно-патогенной флоры, в результате чего развивается дисбиоз, который выражается неприятными симптомами – жжение, характерные выделения, сильный зуд.

Методика бактериологического посева основана на свойстве всех бактерий активно размножаться в питательной среде, что помогает легко выявить состав микрофлоры слизистой оболочки влагалища. При выявлении возможного возбудителя заболевания его перемещают на среды, пропитанные разными видами антибиотиков, и наблюдают за ростом бактерий.

В некоторых лабораториях используют дисковый метод – микроорганизмы высеивают на специальные диски, пропитанные противомикробными препаратами. Отсутствие роста микроорганизма на каком-то определенном диске означает высокую чувствительность к данному препарату, бурное размножение свидетельствует об обратном.

Метод бактериологического исследования с определением антибиотикочувствительности позволяет избежать бессмысленных назначений препаратов, что значительно ускоряет выздоровление и восстановление баланса микрофлоры.

Для чего назначают исследование?

  • Для выявления возбудителя гинекологического заболевания.
  • Выявление нарушения баланса микроорганизмов влагалища.
  • Выяснение чувствительности бактерий к лекарственным препаратам (подбор рациональной схемы лечения).
  • Диагностика неспецифических заболеваний репродуктивных органов женщины.

В каких случаях врач назначает анализ?

Бактериологическое исследование влагалищного отделяемого с определением антибиотикочувствительности показано в тех случаях, когда у женщины отмечаются симптомы воспалительного процесса – сильный зуд, нехарактерные выделения, жжение, боль при половом акте. Помимо этого, показанием к обследованию является отклонения в обычном гинекологическом мазке.

Расшифровка результатов анализа.

В заключение вносят данные о составе и количестве условно-патогенных микроорганизмов, их чувствительность к антибактериальным препаратам. Отдельным списком представлены антибиотики, которые были задействованы в исследовании. В норме во влагалищном отделяемом преобладают лактобациллы, условно-патогенная флора не обнаружена или не превышает значение в 104. Увеличение этого параметра свидетельствует о развитии бактериального вагиноза.

Посев на флору — Цены на процедуры в Москве

Посев на флору с определением чувствительности к антибиотикам – это микробиологический анализ высокой точности, проводящийся в условиях лаборатории. В благоприятную среду помещается биоматериал, в котором развиваются патогенные микроорганизмы. В настоящее время многие современные клиники предлагают такую услугу, в том числе и мы, «Доктор 2000».

Биоматериалом может быть не только микрофлора влагалища, но и мокрота, сперма, грудное молоко, желчь, секрет простаты. Этот анализ дает развернутую картину, имеет приемлемую стоимость и достаточно прост в выполнении. При помощи такого исследования специалист видит полную клиническую картину заболевания пациента, что дает ему возможность поставить правильный диагноз и определить, какую группу антибиотиков назначать для последующего лечения.

Фармакология не стоит на месте, и ассортимент антибиотиков велик, поэтому выделяют два основных способа определения чувствительности:
— к основному спектру антибиотиков;
— к развернутому спектру антибиотиков.

При помощи этой несложной процедуры происходит обнаружение таких микроорганизмов, как стафилококки, стрептококки, энтерококки, неферментирующие бактерии, энтеробактерии. Посев очень важен, так как лечащий врач должен непременно знать, какие именно антибиотики успешно справятся с течением болезни. Именно поэтому наличие аллергии на препарат не принесет должного результата.

Во время анализа просматривается, как биоматериал реагирует на тот или иной вид антибиотика, подавляются ли микроорганизмы предписанными дозами препарата или они остаются устойчивы к его воздействию. От этого во многом зависит правильный подход к локализации очага болезни.

Можно сделать вывод, что посев на флору необходим для установления возбудителя инфекции и подбора надлежащего препарата. Эта мера необходима для того, чтобы в случае нерезультативности предыдущего курса лечения выявить его причину.

Если в результатах вашего анализа вы видите латинскую букву R – это говорит о том, что биоматериал устойчив к действию антибиотика. Если же стоит буква S, значит, был проведен результативный курс лечения.

В заключении нужно отметить, что посев на флору с определением чувствительности к антибиотикам – это лучшее исследование, которое можно провести для правильной постановки диагноза. Он является гарантом не только точной диагностики, но и определяет группу антибиотиков, которые хорошо воспринимает организм пациента.

Бактериологические исследования (бак посев) — (клиники Di Центр)


Чтобы выявить «виновника» заболевания, то есть микроорганизм, вызвавший ту или иную патологию, может быть назначено исследование, называемое

бактериологическим посевом или сокращенно: бакпосев.

Определение

Бактериологический посев — метод исследования биологического материала (кровь, моча, кал и пр.), взятого у пациента и помещенного на искусственную питательную среду, способствующую росту и размножению возбудителя заболевания.

При исследовании можно выявить не только факт наличия возбудителя, но и его концентрацию. Таким образом можно исследовать:

  • кал, мочу, кровь
  • спинно-мозговую жидкость (ликвор)
  • мокроту
  • желчь
  • отделяемое из зева, носа, глаз, дыхательных путей, половых органов, ран.

То есть высевать микроорганизмы можно с практически любого участка организма. Подобные методики удобны для нахождения и идентификации бактерий и грибов, вирусы обнаружить таким образом гораздо сложнее, что связано с особенностями биологии вирусов.

Для чего сдают анализ на бакпосев?

Бактериологические посевы позволяют не только определить типы микробов, провоцирующих то или иное заболевание, но и подобрать эффективные антибиотики (определить чувствительность микробов к ним), которые помогут выздоровлению.

Только забор материала необходимо сделать до начала антибиотикотерапии. Назначать бактериологический посев могут как в поликлинике (например, всем известное исследование кала на дисбактериоз), так и в стационаре (например, при кишечных инфекциях, а также если биологический материал труднодоступен, как ликвор).

Мазок на бак посев в гинекологии

Анализ бак посева (мазок на бактерии) в гинекологии позволяет выявить в полученном материале вид бактерий, определить их количество и чувствительность к антибактериальным лекарственным средствам. Для этих целей может браться посев:

  • уреаплазмы
  • микоплазмы
  • молочницы
  • гарднереллы
  • возбудителя гонореи
  • стафилококки и др.

Забор материала, в зависимости от вида исследования, возможен из:
  • влагалища
  • цервикального канала
  • уретры
  • носа
  • горла
  • соскоба из прямой кишки.

В ряде случаев возможно проведение исследование грудного молока и бакпосев мочи, а также взятие мазка на золотистый стафилококк, стрептококки и энтерококки при беременности.

Посев из прямой кишки берется при подозрении на инфекционную патологию ануса и нижнего отдела кишечника. Анализ выявляет основные инфекции, передающиеся половым путем, попавшие туда после анального секса.

При выполнении анализа бак посева «Медицинский Ди центр» в Саратове, Энгельсе и области всегда проводит определение чувствительности выявленного микроба к антибиотикам в двух вариантах: к основному или расширенному спектру.

Как проходит бактериологический анализ?

После того как материал забирают у пациента, его помещают на специальные питательные среды, через 3−10 дней оценивают результаты. Распознать (идентифицировать) микроб специалисты его микробиологической лаборатории могут путем определения:

  • морфологических
  • культуральных
  • биохимических признаков.

Морфологию (строение) «вредителя» изучают под микроскопом, культуральные свойства характеризуются потребностями, условиями и типом роста микроорганизмов на питательных средах. Биохимические признаки определяются набором ферментов, синтезируемых микробом в процессе жизнедеятельности. Также обращают внимание на пигменты, окрашивающие колонии микроорганизмов и питательные среды, например, золотистый пигмент образует золотистый стафилококк.

Бактериологический анализ (бакпосев) в Саратове и Энгельсе можно сделать в Медицинском Ди центре. Цена на бакпосев совсем не велика и часто бывает, что для сдачи этого анализа специалистов вызывают на дом.
Узнать более точную информацию о времени приема и подготовке к сдаче анализов можно по телефону колл центра: 51−22−51

Посев на патогенную кишечную флору и определение чувствительности к антимикробным препаратам (Stool Culture, Salmonella sp., Shigella sp. Bacteria Identification and Antibiotic Susceptibility testing)

Исследуемый материал Кал

Определение этиологии ОКИЗ (острого кишечного инфекционного заболевания) и выбор рациональной антибиотикотерапии.

Рациональная терапия дизентерии основана на идентификации её возбудителя — бактерий рода Shigella.

Шигеллы (по имени японского учёного К. Шиги) грамотрицательные неподвижные неспороносные палочки длиной 23 мкм, шириной 0,6 мкм. По типу обмена аэробы и факультативные анаэробы.Они выделяют токсины, повреждающие эпителий кишечника, усиливают секрецию жидкости и солей в просвет кишки. Шигеллы быстро изменяют свою чувствительность к различным антибактериальным препаратам.

Заражение происходит фекально-оральным путём. Для возникновения заболевания достаточно инфицирование менее чем 100 микробными клетками шигелл. Инкубационный период от одних до 7 суток (в среднем 2 — 3 суток), но может сокращаться до 12 и даже до 2 часов.
Заболевание начинается остро. Возникает общая интоксикация, повышается температура тела, появляются схваткообразные боли в животе (тенезмы), усиливающиеся перед дефекацией.
В последние годы отмечается резкое увеличение количества больных тяжёлой дизентерией и её хроническими формами. Диагноз хронической дизентерии устанавливается в случае, если заболевание продолжается более 3 месяцев.

Лабораторное подтверждение дизентерии проводится бактериологическим и серологическим методами. Бактериологический метод (высев шигелл из испражнений) при 3-кратном исследовании обеспечивает подтверждение диагноза у большинства больных. Это обеспечивает дифференциальную диагностику с другими острыми диарейными заболеваниями — сальмонеллёзом, эшерихиозом, кишечным иерсиниозом, холерой, амёбиазом.

Сальмонеллы (по имени американского исследователя D. Salmon) – возбудители энтероколитов или пищевой токсикоинфекции, а также генерализованных тифопаратифозных инфекций. Мелкие грамотрицательные палочки, подвижны за счет жгутиков. По типу метаболизма – факультативные анаэробы. Факторы патогенности – термостабильные эндотоксины, термолабильный энтеротоксин, микрокапсулы, белки наружной мембраны клеточной стенки (способствуют адгезии на энтероцитах тонкой кишки). Сальмонеллезы – зоонозно-антропонозные инфекции, могут быть причиной внутрибольничных инфекций. Сальмонеллы могут размножаться при 4-6 град. С и длительно сохраняться в замороженных продуктах. Брюшной тиф и др. сальмонеллезы являются инфекциями с фекально-оральным механизмом передачи, основной путь передачи — пищевой, главным образом через продукты животного происхождения. Заболевание протекает в форме гастроэнтерита, гастроэнтероколита, гастрита (без диареи), тифоподобной форме и септической форме. После перенесенного заболевания в 20% случаев возникает бактерионосительство, которое может продолжаться пожизненно. Лабораторная диагностика сальмонеллеза основана на выделении возбудителя при посеве различных видов биоматериала от больного (фекалии, рвотные массы, желчь, кровь при септических формах) при микробиологическом исследовании.

Выделяемые возбудители: шигеллы, сальмонеллы.

Обращаем внимание на необходимость приобретения стерильной пробирки с питательной средой для взятия биоматериала под залог. Возврат залоговых средств осуществляется при сдаче анализа и при условии наличия чека за внесение залога.

 

Литература

  1. Богомолов Г.И. Дифференциальная диагностика инфекционных болезней. М. 2000. 231 стр.
  2. Энциклопедия клинических лабораторных тестов под ред. Н.У. Тица. Издательство «Лабинформ» — М. — 1997 — 942 с.
  3. Руководство по медицинской микробиологии под.ред.А.С.Лабинской, Москва, 2010г.
  4. Методики клинических лабораторных исследований под ред.В.В.Меньшикова, т.3, Москва, 2009г.
  5. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология, Л.Б.Борисов, Москва, 2005г.
  6. Gorbach S. Et al./ Infectious Diseases (3rd edition)/2003/ Lippincott Williams & Wilkins/2700 ps.
  7. Jacobs D. et al. Laboratory test handbook/ Lexi-Comp./2002 — 1534 p.

Если заболевание имеет бактериальную природу…

В практике работы медицинских учреждений анализ на чувствительность к антибиотикам считается обязательным, если у врача появилось подозрение, что заболевание пациента имеет бактериальную природу. Анализ на чувствительность к антибиотикам – это лабораторный способ выявления препарата, который будет оказывать наибольшее действие на патогенную флору в данном конкретном случае болезни.

 


Как правило, в таких случаях речь идет о диско-диффузионном методе – одном из старейших в арсенале бактериологов, однако и сегодня остающемся наиболее распространенном при оценке антибиотикочувствительности. Прежде всего – потому, что он подходит для исследования большинства патогенов, в том числе и для наиболее распространенных бактерий со сложными питательными потребностями. Универсальным данный метод считается не только потому, что он оптимален для широкого круга антимикробных препаратов, но и потому, что не требует обязательного использования специального оборудования.


Определение чувствительности микроорганизмов – возбудителей инфекционных заболеваний человека к антибактериальным препаратам приобретает все более важное значение в связи с появлением и широким распространением антибактикорезистентности у бактерий. В ходе повседневной деятельности в бактериологических лабораториях из различных биологических материалов и объектов внешней среды выделяют множество бактерий. Однако определение чувствительности выделенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам показано далеко не во всех случаях.

 


Если говорить непосредственно о пациентах, то определение чувствительности нужно, чтобы избежать устойчивости бактерий к лечению. Если пациента недавно лечили антибиотиками, и теперь вновь необходим повторный курс, то требуется замена препарата. Это позволит использовать меньшие дозы лекарства и не вызывать мутации у возбудителя. В гнойных хирургических отделениях антибиотики меняют каждые два-три месяца.


Данный анализ необходим еще в том случае, если на основную группу антибиотиков у больного возникает аллергическая реакция. На языке профессионалов обязательному исследованию на чувствительность к антибактериальным препаратам подлежат все микроорганизмы, выделенные из первично стерильных жидкостей, органов и тканей человека. В остальных случаях оценке чувствительности должна предшествовать оценка клинической значимости микроорганизма. Исследованию по оценке антибиотикочувствительности подлежат чистые культуры микроорганизмов или материал изолированных колоний с плотных питательных сред после первичного посева образца клинического материала с последующей идентификацией культуры.

 


Принцип диско-диффузионного метода состоит в том, что бумажные диски, пропитанные антибиотиками, в чашке Петри раскладывают поверх агара, на который нанесен исследуемый материал. После чашку закрывают и ставят в термостат. Постепенно диск погружается в желатин, а антибиотик диффундирует в окружающее пространство. Вокруг бумаги образуется зона «подавления роста». Чашки проводят в термостате двадцать четыре часа, затем их вынимают и измеряют диаметр вышеуказанной зоны.


Выбранная питательная среда готовится в соответствии с рецептурой. Перед работой необходимо проконтролировать отсутствие конденсата жидкости на внутренней поверхности крышек чашек Петри.


Для определения чувствительности диско-диффузионным методом следует использовать только стандартизированные качественные диски. Чтобы результаты исследования были достоверными, важно строго соблюдать и правила хранения и использования коммерческих дисков – в противном случае содержание в них антибиотиков может оказаться ниже допустимого уровня еще до истечения срока годности.


Небольшие партии, которые используются в повседневной работе, можно хранить в холодильнике при температуре 4-8 градусов по Цельсию, плотно укупоренными так, чтобы гарантировать невозможность попадания во флаконы влаги, кроме того, для дополнительной защиты от влаги во флаконах с дисками коммерческого изготовления содержится специальный влагопоглотитель. Флаконы с дисками следует извлекать из холодильника за 1 час до начала работы и выдерживать герметично закрытыми до достижения ими комнатной температуры.

 


Общим и принципиально важным для всех методов тестирования является стандартизация суспензии исследуемого микроорганизма. Бактериальную суспензию готовят либо из бульонной, либо из агаровой культуры. Для приготовления инокулюма используют чистую суточную культуру микроорганизмов, выросших на плотных питательных средах. Отбирают несколько однотипных, четко изолированных колоний, выросших на неселективных плотных питательных средах. Петлей переносят незначительное количество материала с верхушек колоний в пробирку со стерильным физиологическим раствором или питательным бульоном, доводя плотность инокулюма точно до 0,5 по стандарту МакФарланда. Инокулюм следует использовать в течение 15 минут после приготовления.


Наиболее удобным способом инокуляции является использование стерильных ватных тампонов. Тампон необходимо погрузить в приготовленную суспензию микроорганизма, затем избыток инокулюма удалить, отжав тампон о стенки пробирки. Инокуляцию проводят равномерно штриховыми движениями на всю поверхность агара таким образом, чтобы штрихи плотно прилегали друг к другу, поворачивая чашку Петри на 60 градусов. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10-15 минут.

 


Не позднее чем через 15 мин после инокуляции на поверхность питательной среды наносят диски с АБП. Аппликацию дисков проводят с помощью стерильного пинцета или автоматического диспенсера. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно быть 15-20 мм. Таким образом, на одну чашку диаметром 100 мм следует помещать не более 6 дисков с АБП. Диски должны равномерно контактировать с поверхностью агара, для чего их следует аккуратно прижать пинцетом.


Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри помещают в термостат кверху дном и инкубируют при температуре 35 °С в течение 18-24 ч (в зависимости от вида тестируемого микроорганизма). Увеличение интервала времени между нанесением дисков на поверхность среды и началом инкубации (а соответственно – началом роста исследуемой культуры микроорганизма) приводит к «преддиффузии» АБП в агар и к увеличению диаметра зоны подавления роста.


После окончания инкубации чашки помещают кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет падал на них под углом в 45° (учет в отраженном свете). Диаметр зон задержки роста измеряют с точностью до 1 мм.

 


При измерении зон задержки роста следует ориентироваться на зону полного подавления видимого роста. Не следует обращать внимания на очень мелкие колонии, выявляемые в пределах зоны задержки роста только при особых условиях освещения или увеличении, и едва заметный налет у края зоны. Исключение составляют случаи учета результатов определения чувствительности стафилококков к оксациллину, когда необходимо учитывать и самые мелкие колонии, выявляемые в пределах четкой зоны подавления роста.


Крупные колонии, выявляемые в пределах четкой зоны подавления роста, свидетельствуют о наличии посторонней микрофлоры или о гетерорезистентности популяции микроорганизмов, в этом случае необходимо повторить идентификацию микроорганизма, формирующего эту колонию, и определение чувствительности этого штамма.

 


Условно все микроорганизмы можно разделить на три группы. Деление основывается на устойчивости к антибиотику. Выделяют чувствительные возбудители, умеренно устойчивые возбудители и устойчивые возбудители. Антибиотикограмма (расшифровка латинских букв) говорит о следующем: R – возбудитель, устойчивый к препарату; I – микроорганизм проявляет умеренную устойчивость; S – бактерия, чувствительная к данному антибиотику.

что показывает и как сдают анализ на микрофлору?

Врачи различных специальностей получают множество сведений о состоянии здоровья пациентов не только из его жалоб и полученных во время осмотра данных. Ценную информацию дают современные микроскопические исследования (бактериоскопия) — анализы на микрофлору. Их результаты можно получить довольно быстро, при этом мазки на микрофлору позволяют оценить функциональное состояние органов и систем, выявить заболевания или определить, насколько эффективно лечение.

Анализ мазка на микрофлору: что это и зачем он нужен?

Органы человека, сообщающиеся с внешней средой, имеют обильную и постоянную микрофлору. Это спектр «полезных», болезнетворных и условно патогенных микроорганизмов, число которых в норме должно быть сбалансировано. Соотношение бактерий нарушается, если в организме происходит развитие каких-либо заболеваний и инфекций.

Мазок на микрофлору — это бактериоскопический метод исследования биологического материала. К его основным преимуществам относят доступность и быстроту получения результата. Делается он очень просто: врач аккуратно собирает отделяемое со слизистой оболочки. После этого полученный материал может быть окрашен, обработан солевым раствором или раствором КОН, а затем он тщательно изучается под микроскопом.

Сдав мазок на микрофлору, можно выявить бактерии, грибы и простейшие. Но не всегда можно верно определить их род и вид, ведь они часто бывают схожи или меняются под действием лекарств и других факторов, иногда их концентрация может быть недостаточной. А вот узнать количество микроорганизмов, оценить их форму, размеры и расположение при проведении такого анализа вполне реально. Это позволит получить представление о функциональном состоянии различных органов, оценить наличие или отсутствие воспалительного процесса и степень его выраженности, даже если он протекает без особых проявлений.

Кроме изучения под микроскопом, собранный биологический материал может быть использован для бактериологического анализа-посева на микрофлору. Это лабораторное исследование поможет максимально точно выявить возбудителей инфекций, их пропорциональное соотношение и даже чувствительность к тем или иным антибиотикам.

Виды мазков на микрофлору и показания к их назначению

Существует несколько видов такого лабораторного исследования:

1. Гинекологический мазок на микрофлору . Биоматериалом для проведения гинекологической бактериоскопии служит отделяемое со слизистой влагалища, мочеиспускательного канала или шейки матки.

Показаниями к проведению анализа на микрофлору у женщин являются:

  • боли внизу живота при мочеиспускании;
  • зуд или жжение во влагалище;
  • наличие выделений из влагалища;
  • раздражение в области половых органов;
  • длительный прием антибиотиков.

Это исследование требуется проходить женщинам при планировании беременности и/или в случаях, когда повышен риск заражения инфекциями, передающимися половым путем.

2. Мазок на микрофлору у мужчин . У мужчин материалом для исследования является секрет предстательной железы, сперма и соскоб из уретры.

Такой анализ, как мазок на микрофлору из уретры назначается всем без исключения при обращении к врачу урологического отделения или венерологу при профилактическом осмотре. Он необходим при:

  • наличии непривычных выделений из наружного отверстия мочеиспускательного канала;
  • подозрении бесплодия;
  • ощущении боли или дискомфорта в мочеиспускательном канале;
  • любом заболевании, передающимся половым путем.

3. Мазок из носа и зева на микрофлору . Материалом для проведения анализа на микрофлору из зева или носа является отделяемое со слизистой оболочки этих органов.

Назначается он при:

  • ангине с налетом, стенозирующем ларинготрахеите, гнойных образованиях рядом с миндалинами или мононуклеозе на фоне инфекции;
  • туберкулезе;
  • рините, синусите и фарингите;
  • частом насморке или болезнях горла.

Мазок изо рта на микрофлору — это еще и обязательный анализ при подозрении на дифтерию или коклюш.

4. Мазок из уха на микрофлору . Мазок на микрофлору из уха назначают при наружных, средних и внутренних отитах гнойного или серозного характера, так как данный анализ показывает, что вызвало заболевание и какой следует назначить антибиотик. Материал берется только со слизистой наружного уха.

Как сдается биоматериал на исследование и как подготовиться к забору

Результаты посева мазка на микрофлору будут достоверными и информативными в том случае, если пациент соблюдает правила подготовки к забору биологического материала, а процедура выполнена врачом правильно.

Мазок на микрофлору в гинекологии проводится только в то время, когда у женщины нет менструального кровотечения. За 1–2 дня перед этим анализом нельзя:

  • вступать в половой контакт;
  • делать спринцевания;
  • пользоваться лубрикантами;
  • принимать ванную.

В день проведения гинекологической бактериоскопии не желательно мыть наружные половые органы, используя моющие средства, а за 2–3 часа до анализа их не рекомендуется даже мочить.

Забор мазка на микрофлору у женщин производится со слизистой влагалища, мочеиспускательного канала или шейки матки. Взятие материала осуществляется с помощью медицинского шпателя — пластмассовой палочки с расширенным концом. Им же врач-гинеколог распределяет материал по чистому предметному стеклу и присваивает мазкам из разных участков буквенные обозначения: «C» — шейка матки, «U» — уретра, «V» — влагалище.

Кстати!
Мазок из влагалища — полностью безопасное и безболезненное обследование. Сбор пробы похож на обычный гинекологический осмотр.

Если врач-уролог назначил мужчине проведение мазка из мочеиспускательного канала, ему следует:

  • за 1–2 дня до проведения исследования отказаться от половых контактов;
  • вечером накануне взятия биоматериала провести гигиену наружных половых органов;
  • за 2–3 часа до визита к врачу постараться не мочиться;
  • за 7 дней до обследования прекратить прием лекарств, использование которых не согласовывалось с врачом.

Забор мазка на микрофлору из мочеиспускательного канала мужчины длится всего 2–3 минуты. В мочеиспускательный канал вводится специальный зонд на глубину 4–5 сантиметров и извлекается вращательными движениями.

Довольно часто мазок из зева на микрофлору дает ложный результат. Это связано с тем, что пациент нарушает правила подготовки к исследованию. А ведь они очень просты! Во время подготовки к сдаче мазка из зева на микрофлору нужно:

  • ничего не есть до обследования;
  • за 2 часа до анализа ничего не пить;
  • не чистить зубы и не полоскать горло до забора материала.

Также, перед тем как сдавать мазок из зева на микрофлору, нельзя использовать растворы для полоскания горла или спреи, содержащие противомикробные средства или антибиотики. Сама процедура получения образца биологического материала безболезненна и проста. Берется он ватной палочкой, которая вводится в рот и осторожно прижимается к поверхности задней стенки глотки и миндалин.

Важно знать!
Процедура взятия мазка из горла на микрофлору безболезненна, но неприятна. Это связано с тем, что прикосновение к стенкам глотки у некоторых людей вызывает рвотный позыв.

За несколько суток до проведения анализа из носа на микрофлору нужно исключить применение растворов и мазей для носа, содержащих антибиотики. Биологический материал извлекается ватной палочкой и наносится на предметное стекло.

Анализ на микрофлору из уха точно и достоверно показывает, что вызвало отит, если проводится до начала антибактериальной терапии. Мазок берется ватной палочкой и наносится перекатыванием на предметное стекло. Каждое стекло маркируется, чтобы можно было различить исследование, взятое из левого и правого уха.

Что показывает анализ на микрофлору: норма и патологии

Цена анализа на микрофлору у женщин невысокая по сравнению с другими комплексными гинекологическими обследованиями. Но при этом анализ позволяет выявить:

  • бактериальный вагиноз;
  • аэробный и атрофический вагинит;
  • кандидоз;
  • воспаление, вызванное гонореей или трихомониазом;
  • другие заболевания.

В результатах лабораторного исследования гинекологического мазка на флору указываются следующие данные:

  • лейкоциты — норма их содержания во влагалище и мочеиспускательном канале не более 10-ти единиц в поле зрения, в канале шейки матки — не более 30-ти. Превышение референсных значений свидетельствует о наличии воспалительного процесса.
  • плоский эпителий — норма этих клеток зависит от фазы менструального цикла. Обычно их количество не превышает 10-ти. Если эпителий не обнаружен, это свидетельствует об атрофии эпителиального слоя, а вот повышение количества — признак воспаления.
  • лактобациллы — в норме эти палочки присутствуют в большом количестве (до 90% всей микрофлоры). Снижение значений наблюдается при бактериальном вагинозе.
  • дрожжи — в состав нормальной флоры они входят в количестве не более 10 4 КОЕ/мл. Повышение их нормы характерно для кандидоза.
  • «ключевые» клетки — наличие большого их количества (больше 20% от общего количества эпителиальных клеток) является одним из признаков бактериального вагиноза.
  • лептотрикс, мобилункус, трихомонада — бактерии, встречающиеся при кандидозе, бактериальном вагинозе, трихомониазе и хламидиозе.
  • гонококки (диплококки) — присутствуют в мазке при гонорее.
  • кокки (стрептококки, стафилококки, энтерококки) — в небольшом количестве входят в состав нормальной флоры, но их увеличение свидетельствует о наличии инфекции и требует проведения бактериологического посева.

На заметку
При беременности нормы некоторых показателей в результатах анализа мазка на микрофлору могут быть увеличены.

Мазок на микрофлору у мужчин помогает выявить уретрит, простатит, хламидиоз, гонорею, трихомониаз, уреапламоз и микоплазмоз. В расшифровке результата встречаются:

  • лейкоциты — присутствие лейкоцитов допустимо в количестве не более 5-ти. Показатели выше нормы свидетельствуют о наличии воспалительного процесса, простатита или уретрита.
  • эпителий — если эпителия в мазке более 10-ти, в мочеиспускательном канале проходит воспалительный процесс.
  • гонококки — их присутствие в мазке свидетельствует о гонорее.
  • прочие кокки (стрептококки, стафилококки или энтерококки) — в большой концентрации они являются признаком уретрита.
  • трихомонады — их выявление является подтверждением трихомониаза.

В результатах мазка из уха дается информация о количестве условно-патогенных микроорганизмов (стрептококков, стафилококков или энтерококков) и дрожжеподобных грибов. Нормальный показатель — не более 10 4 КОЕ/тампон.

В мазке из носа или зева на микрофлору обычно обнаруживаются такие организмы, как:

  • коринобактерии дифтерии;
  • гемолитические стрептококки;
  • пневмококки;
  • золотистый стафилококк;
  • менингококк;
  • гемофильная палочка;
  • листерия;
  • другие микробы.

Если их содержание не превышает 10 4 КОЕ/мл, нет никакой необходимости проводить профилактическое лечение, чтобы очистить от них горло или нос.

Такой анализ, как мазок из зева на микрофлору проводится для выявления типа микроорганизмов, которые вызвали ЛОР-заболевания, и их чувствительности к антибиотикам. В результатах указывается латинское наименование выявленных бактерий и стоят значки «+» напротив названий антибиотиков. Чем больше «+», тем чувствительность к данному препарату выявленного микроба выше.

Итак, мазок на микрофлору — достоверный и простой метод диагностирования различных заболеваний с широким спектром применения. Но только при верной расшифровке, которую может дать квалифицированный врач, лабораторные данные такого исследования дадут возможность поставить верный диагноз, подобрать соответствующее лечение и предотвратить переход болезней в хроническую форму.


Руководство по идентификации бактериальных культур и интерпретации результатов

Реферат

Цель

Предоставить руководство по интерпретации результатов бактериальных культур.

Методы

Исследования были выявлены с помощью поиска в литературе PubMed (с 1966 по январь 2018). Поисковые запросы включали тесты на микробную чувствительность, микробную устойчивость к лекарствам и противоинфекционные агенты / фармакологию. Статьи включались, если они были опубликованы на английском языке. Также были рассмотрены ссылки в указанных статьях.

Результаты

В этой статье рассмотрены основные концепции интерпретации результатов бактериального посева, включая время посева, общие места посева, возможность контаминации, интерпретацию окраски по Граму, роль быстрых диагностических тестов, стандартное тестирование чувствительности к антибиотикам и автоматическое тестирование.

Заключение

Это руководство может помочь фармацевтам в их роли в качестве неотъемлемых членов группы контроля над антимикробными препаратами в усилиях по улучшению ухода за пациентами.

Ключевые слова: тесты микробной чувствительности, микробная лекарственная устойчивость, противоинфекционные агенты / фармакология, фармакокинетика

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время существует нехватка фармацевтов, обученных инфекционным заболеваниям, для заполнения должностей по управлению антимикробными препаратами в Соединенных Штатах. Это означает, что фармацевты на различных других должностях должны взять на себя эти роли, чтобы улучшить назначение соответствующих антибиотиков. 1 Исследования показывают, что в условиях стационара примерно 50% пациентов получают хотя бы один антибиотик во время пребывания в стационаре, 30% из которых включают антибиотики широкого спектра действия. 2 5 Сообщается, что нецелевое использование антибиотиков достигает 50%, хотя оценки могут варьироваться в зависимости от учреждения и от того, как определяется термин «уместность». 6 9 Неправильное использование может привести к усилению побочных эффектов, вторичным инфекциям, лекарственным взаимодействиям, дополнительным затратам, увеличению продолжительности пребывания в больнице и повторной госпитализации. Кроме того, может развиться резистентность бактерий, что может привести к неэффективности лечения. 9 , 10 В этой статье рассматриваются сроки посева, общие места посева, интерпретация окраски по Граму, роль экспресс-тестов, обычных тестов на чувствительность к антибиотикам и автоматизированного тестирования.На протяжении всей статьи мы используем термин антибиотик вместо противомикробный , поскольку мы не охватывали тестирование вирусов или грибков.

ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУР

Медицинские работники должны быстро получить посевы для проведения терапии, одновременно принимая во внимание важность быстрого введения антибиотиков. 11 Руководящие принципы Кампании по борьбе с сепсисом 2016 г. рекомендуют вводить антибиотики в течение одного часа после постановки диагноза сепсиса, а посевы не должны откладывать введение антибиотиков более чем на 45 минут. 12 У пациентов с сепсисом введение соответствующих антибиотиков в течение одного часа может снизить смертность. 13 Получение посевов перед введением антибиотиков может помочь клиницистам определить возбудителя болезни, что позволит снизить эскалацию за счет надлежащего лечения. Если посевы отбираются после введения антибиотика, может наблюдаться снижение результатов посева крови, что может увеличить стоимость и продолжительность пребывания пациента. 14 16

Культуры можно получить из участков, которые либо заселены бактериями, либо стерильны.Колонизированные бактериями увеличивают риск заражения нормальной флорой и могут привести к ложным результатам . Сайты, которые обычно считаются стерильными, включают спинномозговую жидкость, кровь и перикардиальную жидкость. Места, которые хорошо известны заражением, включают мокроту и носовые ходы. 17 Неправильная техника сбора посевов может также увеличить риск заражения. Ниже приведены рекомендации по интерпретации результатов для крови, дыхательных путей, мочи, кожи и мягких тканей, костей и суставов, спинномозговой жидкости и посевов стула.

Культуры крови

При оценке культур крови важно различать бактериемию и контаминацию. Заражение происходит, когда в собранный образец попадают бактерии из внешнего источника. 18 Например, нормальные кожные бактерии могут быть занесены при проведении венепункции с помощью одной иглы. Бактерии также могут присутствовать в медицинских устройствах, таких как центральные венозные катетеры. Центральные венозные катетеры связаны с более высоким уровнем заражения, чем венопункция.Темпы выявления загрязнителей растут, поскольку новые методы тестирования улучшают идентификацию бактерий даже в небольших количествах.

При оценке потенциального заражения клиницист должен оценить клинические проявления пациента и определить, проявляет ли он или она признаки и симптомы бактериемии. Например, если у пациента была гипотензия, тахикардия и лихорадка, это может указывать на наличие бактериемии. Кроме того, очень важно брать как минимум два образца с разных участков тела.Второе место — это часто центральный венозный катетер, если он есть. Если в одной из двух культур растет организм, который считается вероятным контаминантом, необходимы повторные посевы. И наоборот, если один и тот же организм выращивается в нескольких образцах, результатом обычно является настоящая бактериемия. 19 , 20 Только одна положительная культура необходима, чтобы предположить истинную инфекцию у пациентов с грамотрицательными бактериями. 21 грамположительные бактерии, особенно виды Staphylococcus epidermidis и Corynebacterium , с большей вероятностью могут быть контаминантами. 22 Одно исследование по оценке 500 посевов крови показало, что видов Staphylococcus epidermidis и Corynebacterium были контаминантами в 94% и 79% случаев соответственно. Однако в таких популяциях, как пациенты с ослабленным иммунитетом, эти две бактерии могут представлять настоящую инфекцию. Грамположительные бактерии, ассоциированные с истинной инфекцией, включают Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoniae . Следует брать повторные посевы, чтобы гарантировать разрешение бактериемии.

Респираторные культуры

Для диагностики пневмонии многие клиницисты заказывают посев мокроты, эндотрахеальный аспират и, реже, бронхоальвеолярный лаваж. Они выполняются в дополнение к оценке признаков и симптомов (кашель, лихорадка, выделение мокроты, плевритная боль в груди) и рентгенографии грудной клетки. 23 Посев мокроты может быть трудно интерпретировать, потому что верхние дыхательные пути колонизированы бактериями, в отличие от нижних дыхательных путей, которые обычно стерильны. 24 Сообщения о чувствительности и специфичности посевов мокроты широко различаются. 23 Если получена культура мокроты, необходимо отметить наличие эпителиальных клеток, которые могут указывать на загрязнение культуры. Культуры мокроты должны содержать менее 10 эпителиальных клеток на поле с малым увеличением. В определенных группах пациентов, например, с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ), у которых наблюдается обострение, следует избегать посева мокроты. 25 Вместо того, чтобы использовать такие культуры для определения наличия инфекции, в рекомендациях Глобальной инициативы по хронической обструктивной болезни легких от 2017 г. рекомендуется оценивать симптомы пациента, такие как выделение мокроты, гнойность и одышка.У пациентов, находящихся на искусственной вентиляции легких, посевы обычно получают путем эндотрахеальной аспирации или бронхоальвеолярного лаважа. Эндотрахеальная аспирация имеет более низкую специфичность, чем бронхоальвеолярный лаваж для диагностики пневмонии, хотя она имеет меньше осложнений и более низкую стоимость. 26 Эта более низкая специфичность может привести к более высокому использованию антибиотиков. Рекомендации различаются в зависимости от предпочтения эндотрахеальной аспирации или бронхоальвеолярного лаважа, поскольку выбор основан на деэскалации антибиотиков или стоимости и осложнениях этих методов. 27 , 28 Клиницисты должны руководствоваться стандартами своего учреждения, когда рекомендуют эндотрахеальную аспирацию или бронхоальвеолярный лаваж.

Посев мочи

Посев мочи следует отбирать только при подозрении на инфекцию, обычно при наличии симптомов, о которых сообщает пациент. 29 Типичные симптомы инфекции мочевыводящих путей включают дизурию, частоту и неотложность позывов, хотя пациенты с деменцией могут проявлять неспецифические признаки, такие как усталость и изменения психического статуса. 30 У пациентов с мочевыми катетерами симптомы носят более общий характер и могут включать лихорадку, слабость и изменение психического статуса. 31 Скрининг бессимптомной бактериурии следует проводить только у беременных или у пациентов, подвергающихся урологическим процедурам. 29 При обследовании пациента с потенциальной инфекцией мочевыводящих путей (ИМП) следует оценивать посев мочи вместе с симптомами и анализом мочи. Десять или более лейкоцитов на микролитр в анализе мочи связаны с диагнозом ИМП, но это не должно быть единственным критерием, используемым для диагностики.Посевы у пациентов без мочевых катетеров лучше всего собирать в середине потока, чтобы избежать заражения. В посеве мочи количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл является оценкой количества бактерий в образце. Более 10 3 КОЕ на мл в посеве мочи связано с инфекцией. Однако истинная инфекция может возникать у пациентов с более низкими КОЕ при наличии симптомов и лейкоцитов в моче. 32 Пациенты с катетер-ассоциированными ИМП также имеют более низкие КОЕ.И наоборот, более высокое количество КОЕ может иметь место в присутствии контаминантов и после неправильно взятого образца. Бактерии, которые обычно не наблюдаются при ИМП, могут быть вызваны контаминацией, за исключением случаев, когда у пациента есть факторы риска для других типов бактерий и образец не собирается надлежащим образом. Обычные бактерии при неосложненных ИМП включают видов Escherichia coli , видов Klebsiella , видов Proteus и Staphylococcus saprophyticus .

Инфекции кожи и мягких тканей

Американское общество инфекционных болезней (IDSA) рекомендует делать посевы на абсцессы и карбункулы, хотя они упоминают эмпирическое лечение без посева как разумное. 33 При целлюлите IDSA рекомендует проводить посев крови только при наличии у пациента определенных факторов. К этим факторам относятся: иммуносупрессия, злокачественные новообразования, укусы животных и / или иммерсионные травмы. 34 Посев на поверхность кожи следует получать только при гнойном дренаже. Получение кожных культур при инфекциях без дренажа часто приводит к идентификации полимикробных организмов, которые не являются причиной инфекции, что приводит к чрезмерно широкому лечению. 35 Как и в случае ИМП, для постановки диагноза важны анамнез пациента и обследование.Пациенты с гнойным дренажом с большей вероятностью будут инфицированы S. aureus , , а пациенты с негнойным целлюлитом с большей вероятностью будут инфицированы стрептококками группы А. 36

Инфекции костей и суставов

Бактериальные инфекции суставов и костей могут возникать при попадании бактерий из крови, протезов, травм или распространения кожной инфекции. Знание источника может помочь предсказать, какие бактерии могут быть причиной. Типичные симптомы совместных инфекций включают лихорадку, болезненные и опухшие суставы, болезненность и уменьшение диапазона движений. 37 Пациенты с протезами суставов или недавними операциями на суставах (обычно <3 месяцев) более подвержены инфекциям суставов. 38 Совместные инфекции диагностируются с помощью посевов синовиальной жидкости, когда жидкость берется во время операции или путем аспирации. Повышенное количество лейкоцитов (WBC) в синовиальной жидкости, особенно когда количество превышает 50 000 клеток / мм 3 , может помочь в исключении (специфичность 90%), но не исключить (чувствительность 56%) инфекции суставов. 39 Окраска по Граму также имеет низкую чувствительность (45–71%) для диагностики инфекций суставов.Наконец, оценка содержания белка или глюкозы в синовиальной жидкости не помогает в диагностике. Пациенты с остеомиелитом обычно проявляют симптомы лихорадки, вялости, воспаления, эритемы и отека. 40 Посевы костной биопсии и рентгенограммы играют важную роль в диагностике остеомиелита, наряду с выявлением возбудителя. Также могут быть взяты посевы крови для определения организма при гематогенном остеомиелите. Наконец, у пациентов обычно наблюдается повышенное количество лейкоцитов, повышенная скорость оседания эритроцитов и повышенный уровень С-реактивного белка, хотя это не может быть использовано в диагностике без посева. 41

Культуры спинномозговой жидкости

Культуры спинномозговой жидкости (ЦСЖ) играют важную роль в диагностике менингита. 42 Культуры спинномозговой жидкости, связанные с нелеченым бактериальным менингитом, обычно показывают повышенное количество лейкоцитов (> 1000 клеток / мм 3 ), хотя может наблюдаться более низкое количество лейкоцитов. Повышение количества лейкоцитов также может произойти, если люмбальная пункция травматична. Общее правило состоит в том, что каждые 1000 эритроцитов в спинномозговой жидкости увеличивают количество лейкоцитов в спинномозговой жидкости на единицу. 43 Нейтрофилы обычно> 80%, хотя у 10% пациентов можно увидеть лимфоциты> 50%. Кроме того, при бактериальном менингите посевы спинномозговой жидкости часто имеют высокое содержание белка (> 0,9 г / л), поскольку белок имеет повышенное проникновение в спинномозговую жидкость при наличии воспаления менингеальной оболочки. 44 При бактериальном менингите глюкоза утилизируется бактериями; следовательно, можно увидеть низкий уровень глюкозы в спинномозговой жидкости (<40 мг / дл) или соотношение между глюкозой в спинномозговой жидкости и глюкозой в сыворотке (≤ 40%). Давление открытия при люмбальной пункции также может быть выше 200 мм H 2 O. 43 Окраска по Граму полезна для диагностики пациентов с бактериальным менингитом, особенно с большим количеством бактерий. Сообщается, что в некоторых случаях специфичность окраски по Граму достигает 97%. Наконец, полимеразная цепная реакция (ПЦР) обладает высокой чувствительностью и специфичностью и может использоваться для исключения бактериального менингита, если окраска ЦСЖ по Граму и культура отрицательны. 45

Культуры кала

Посевы кала могут быть рассмотрены у пациентов, которые поступают с постоянной диареей или кровавой диареей или которые недавно побывали в районах с плохой общественной системой санитарии.Достаточно получить один посев кала, который позволяет обнаружить патоген в 87–94% случаев. 46 Лаборатории регулярно проводят скрининг бактерий, таких как Salmonella, Shigella, E. coli и Campylobacter , в культурах стула. Кроме того, исследование Clostridium difficile может быть рассмотрено у пациентов с факторами риска инфекции, такими как принимавшие антибиотики в течение последних двух месяцев, имеющие более двух несформированных испражнений за 24 часа, увеличение количества лейкоцитов, ухудшение функции почек и снижение альбумина. 47 Существует несколько тестов для обнаружения C. difficile . Чаще всего эти тесты включают иммуноферментный анализ на токсины A и B, иммуноферментный анализ на глутаматдегидрогеназу (GDH) и молекулярный анализ. Большинство лабораторий сначала проводят иммуноанализ на токсины A и B, обычно одновременно с анализом на GDH. Совместное использование этих двух тестов имеет высокую специфичность (97% или выше), но чувствительность тестов ниже (41–92%). 48 , 49 Если иммуноферментный анализ на токсины A и B, а также GDH положительны, то C.difficile скорее всего . Если один из них положительный, а другой отрицательный, следует провести дальнейшее тестирование с помощью молекулярных анализов, так как это может улучшить чувствительность и специфичность. Тестирование после разрешения бесполезно, так как посев кала будет оставаться положительным в течение нескольких недель после заражения.

РАННЕЕ ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИАЛОВ

Важно проводить тестирование на чувствительность к антибиотикам, поскольку оно помогает врачам выбрать подходящую схему лечения инфекции.Различные подходы к ранней идентификации бактерий включают окрашивание по Граму, масс-спектрометрию с лазерной десорбцией / ионизацией с использованием матрицы (MALDI-TOF), ПЦР, технологию зондов с наночастицами и флуоресценцию пептидных нуклеиновых кислот in situ (PNA-FISH).

Окрашивание по Граму

Окрашивание по Граму — это диагностический тест, который дает раннее выявление потенциальных бактерий посредством визуализации бактерий. Окрашивание по Граму помогает дифференцировать организм, будь он грамположительным или грамотрицательным. 50 Грамположительные бактерии имеют пурпурный цвет, а грамотрицательные — розовый. Кроме того, форма, расположение и размер организма могут предоставить дополнительную информацию, которая поможет идентифицировать организм. Обычно при окрашивании по Граму видны кокки, похожие на сферы; бациллы, напоминающие палочки; или коккобациллы, которые представляют собой комбинацию этих двух. Кокки могут быть расположены в виде узоров, таких как группы или цепочки; например, виды Staphylococcus появляются в виде грамположительных кокков в скоплениях.Размер может помочь микробиологу различать бациллы, хотя врачу об этом не часто сообщают.

Для окрашивания по Граму технический специалист наносит бактерии на предметное стекло, а затем пропускает его над пламенем, чтобы убедиться, что бактерии остаются на предметном стекле. Затем наносится кристально-фиолетовый краситель, который окрашивает все бактерии в пурпурный цвет. Затем применяется йод, который помогает красителю связываться с пептидогликановым слоем клеточной стенки, а затем ацетон, который смывает краситель. Пурпурный краситель остается на грамположительных бактериях в результате прочной связи между бактериями и толстым пептидогликановым слоем, но он смывается с грамотрицательных бактерий, которые имеют тонкий пептидогликановый слой.Наконец, применяется краситель, такой как сафранин, который окрашивает грамотрицательные бактерии в розовый цвет. 51 Другие тесты могут быть выполнены для дальнейшей дифференциации бактерий. Чашки с агаром MacConkey можно использовать для дифференциации грамотрицательных бактерий, ферментирующих лактозу, и бактерий, не ферментирующих лактозу. Тест на коагулазу можно использовать для дифференциации между золотистым стафилококком и другими видами стафилококка . Если тест на коагулазу положительный, вероятно, это бактерии. Staphylococcus aureus ; если он отрицательный, вероятно, бактерии Staphylococcus epidermis или Staphylococcus saprophyticus.

Понимание закономерностей предварительного роста организмов может помочь клиницистам выбрать подходящий антибиотик. Блок-схема предназначена для помощи в предварительной идентификации бактерий. Однако чувствительность и специфичность окраски по Граму могут широко варьироваться; поэтому перед деэскалацией проводится дальнейшая микробиологическая идентификация. 52 , 53 Тем не менее, окраска по Граму является полезным инструментом при проведении эмпирической терапии до получения окончательных результатов посева.

Классификация распространенных грамположительных и грамотрицательных бактерий

Быстрые диагностические тесты

Быстрые диагностические тесты могут помочь в более быстром выявлении и снижении эскалации антибактериальной терапии. Фармацевты сыграли решающую роль в предоставлении поставщикам рекомендаций на основе этих тестов. 54 , 55 Эти системы быстрой диагностики включают MALDI-TOF, ПЦР, PNA-FISH и технологию датчиков наночастиц. MALDI-TOF можно объяснить, разложив аббревиатуру.Для выполнения MALDI-TOF образец выращивают на чашке с агаром и помещают на чашку MALDI, после чего добавляют матрицу. MA trix помогает преобразовать L asser в тепло, которое заставляет образец превращаться в D esorb с пластины и образовывать I onized молекулы. Молекулы превращаются в газ, который затем летит в лампу T ime- O f- F в зависимости от их размера и заряда. Молекулы с меньшим отношением размера к заряду движутся быстрее, что создает спектр, основанный на размере и заряде молекул.Этот спектр соответствует библиотекам спектров для известного организма, такого как Escherichia coli . Спектры также коррелируют со значением баллов на машине MALDI-TOF, которое указывает вероятность правильного определения тестируемого рода и / или вида. 56 Основным преимуществом MALDI-TOF является быстрая (менее пяти часов) идентификация бактерий. Однако в настоящее время тест не предоставляет информации о чувствительности и не может обнаружить гетерорезистентность.Гетерорезистентность возникает, когда субпопуляция бактериальных клеток проявляет более высокую устойчивость к антибиотикам, чем остальная часть культуры. 57

Альтернативным методом быстрой идентификации является ПЦР, которая работает путем создания множественных копий сегментов ДНК, используемых для идентификации бактерий. Для проведения ПЦР необходимы сегмент ДНК, нуклеотиды, полимераза и праймер. 58 ДНК нагревается, в результате чего она расщепляется на две отдельные нити. Эти нити праймируются, а затем полимераза создает новые нити ДНК, используя нуклеотиды.Процесс повторяется, чтобы сделать несколько копий сегментов ДНК, которые можно проанализировать для идентификации микроба. Преимущества ПЦР включают быструю идентификацию (менее одного часа) бактерий и способность обнаруживать бактерии, пока пациент находится на антибактериальной терапии. Но этот метод также имеет некоторые ограничения, поскольку ПЦР может обнаруживать бактерии, которые становятся нежизнеспособными после лечения пациента от инфекции. 59 Кроме того, точность может снизиться при полимикробных инфекциях. Мультиплексная ПЦР, расширение ПЦР, решает эту проблему за счет использования нескольких праймеров, что позволяет идентифицировать несколько бактерий.Это также позволяет обнаруживать гены устойчивости к антибиотикам.

Технология наночастиц также использует ДНК для идентификации бактерий. Этот тест, в котором используются наносетки (слайды, покрытые ДНК) для связывания с грамположительной или грамотрицательной ДНК, используется только у пациентов с положительными культурами крови. 60 Когда происходит связывание, прикрепляются наночастицы золота, затем раствор смывается с предметного стекла, и раствор связывается с золотом. Свет, пропущенный через слайды, позволяет визуализировать серебро, рассеивая свет в камере.Преимущества этого теста заключаются в быстрой идентификации (менее трех часов) большого количества бактерий и механизмов устойчивости. Его ограничения включают требование положительного посева крови и тот факт, что не все потенциальные патогены можно идентифицировать.

В отличие от ПЦР и технологии нанозондов-частиц, которые идентифицируют бактерии путем обнаружения ДНК, PNA-FISH идентифицирует бактерии с помощью зондов для идентификации рибосомной РНК. PNA-FISH также можно объяснить, разложив аббревиатуру.В этой процедуре зонды F люоресцентные p eptide- n ucleic a cid ( PNA ) наносят на бактерии, закрепленные на предметном стекле. 61 Эти зонды H гибридизуются (связываются) с рибосомной РНК и просматриваются под флуоресцентным микроскопом в реальном времени ( I n S itu) . Преимущества PNAFISH включают быстрое обнаружение (менее одного часа), возможность идентифицировать бактерии, которые труднее выращивать традиционными методами (анаэробы, виды Mycoplasma ) и меньшую стоимость по сравнению с ПЦР.Основным недостатком PNA-FISH является то, что исследователь должен предвидеть потенциальные бактерии, поскольку разные бактерии имеют разные наборы. Информация о окраске по Граму может помочь в выборе подходящего набора. Таким образом, если росли лактозоположительные грамотрицательные бациллы, технический специалист выбрал бы набор для использования с E. Coli / P. Aeruginosa . Кроме того, PNA-FISH может обнаруживать лекарственную устойчивость только в том случае, если возникают мутации с рибосомной РНК.

ОБЫЧНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИАЛОВ И ТЕСТИРОВАНИЕ НА АНТИБИОТИКУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ

Обычная идентификация бактерий заключается в окрашивании по Граму с последующей идентификацией бактерий и тестированием на чувствительность к антибиотикам.Процесс от начала до конца может занять до пяти дней, что может задержать время до деэскалации антибиотиков. 59 Стандарты чувствительности к антибиотикам в США определяются Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), что в основном относится к стандартам, установленным Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI). Стандарты могут отличаться в других странах, что может привести к расхождениям в определении чувствительности к антибиотикам; это привело к созданию Национального комитета по тестированию на чувствительность к противомикробным препаратам США (USCAST).Этот комитет работает с Комитетом Европейского Союза по тестированию на чувствительность к противомикробным препаратам, чтобы нормализовать стандарты на международном уровне. Для определения чувствительности к антибиотикам используются количественные данные, которые далее разбиваются на качественные категории, как показано на рис.

Таблица 1

Окончательный отчет о чувствительности к антибиотикам для Klebsiella Pneumoniae

3 3 Amikill Cefazolin Cefazolin ≥ 64 9 0353 R
МИК (мкг / мл) Интерпретация
≥ 32 R
Ампициллин / Сульбактам 16 I
Цефазолин ≥ 64 R
R
Ципрофлоксацин ≥ 64 R
ESBL * NEG
Gentamicin Gentamicin 1 S
Пиперациллин ≥ 128
Пиперациллин / тазобактам 1.5 S
Тигециклин ≤ 0,5 S
Тобрамицин 8 I
Испытание на триметоприм / сульфаметоксазол выполняется путем определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК). МПК — это самая низкая концентрация антибиотика, необходимая для подавления роста организма. Самый низкий МПК не всегда коррелирует с наиболее эффективным лечением, поскольку разные антибиотики достигают разных концентраций в разных местах. 62 Для определения качественных категорий используются конкретные значения МИК, также известные как контрольные точки, для классификации бактерий как чувствительных, промежуточных или устойчивых к определенному антибиотику. Для определения контрольных точек CLSI использует фармакокинетические, фармакодинамические механизмы, механизмы резистентности и клинические данные.

CLSI определяет как чувствительные те изоляты, которые ингибируются типичными достижимыми концентрациями антибиотика при использовании дозировки, рекомендованной для лечения очага инфекции. 63 Дозозависимая чувствительная категория определяется, когда требуется режим дозирования, который приводит к большему воздействию лекарственного средства, чем тот, который используется в чувствительной категории для достижения клинической эффективности. Промежуточная категория включает изоляты, которые достигают обычно достижимых уровней в крови и тканях с помощью антибиотиков, а показатели ответа ниже, чем у чувствительных изолятов. Наконец, категория резистентности включает изоляты, которые не ингибируются обычными достижимыми концентрациями антибиотиков или для которых вероятны механизмы резистентности, а клиническая эффективность антибиотиков достоверно не доказана.

Тестирование диффузии

Диско-диффузионный метод, или метод Кирби-Бауэра, является распространенным тестом, используемым для определения чувствительности к антибиотикам (см.). При тестировании диффузии диск с антибиотиком помещается на пластину с агаром, содержащую бактерии. Планшет инкубируют до 24 часов, и в течение этого времени антибиотик диффундирует по всему планшету, образуя градиент концентрации, окружающий диск. 64 Чем меньше концентрация антибиотика, тем выше вероятность роста бактерий.Диаметр области, на которой нет роста, измеряется для определения восприимчивости в соответствии с рекомендациями CLSI. Большие зоны указывают на снижение роста бактерий с большей чувствительностью к антибиотикам, тогда как меньшие зоны показывают усиленный рост бактерий с меньшей чувствительностью к антибиотикам. Если антибиотик не подавляет рост, зоны подавления нет, следовательно, бактерии устойчивы.

Дисковая диффузия (метод Кирби-Бауэра)

Тестирование разведения

Обычные тесты разведения включают разведение в бульоне и разведение в агаре.В обоих тестах бактерии помещают на несколько планшетов, пробирок или лунок, содержащих определенную концентрацию антибиотика. 64 Например, максимальная концентрация антибиотика в наборе лунок может составлять 4,0 мкг / мл. Следующая лунка после одного разведения будет иметь концентрацию 2,0 мкг / мл, затем 1,0 мкг / мл после двух разведений и 0,5 мкг / мл после трех разведения. Пример микроразбавления бульона показан на, а разведение в агаре показано на. Результаты теста на разведение могут отличаться, и обычно бывает однократная ошибка разведения.Например, если определено, что МИК составляет 1 мкг / мл, истинный диапазон МИК может составлять от 0,5 до 2 мкг / мл. Это может быть проблематично, если диапазон включает чувствительные и промежуточные значения MIC.

Разбавление бульона состоит из микроразведения и макроразбавления. Несмотря на то, что они похожи, методы различаются в первую очередь модальностью, которая используется для проведения теста на чувствительность (лунки или пробирки). 65 Микроразбавление бульона выполняется путем помещения различных антибиотиков с разной концентрацией в лунки, содержащие жидкую среду, как показано на рис.Бактерии добавляются в каждую лунку, и лоток инкубируется. Присутствие бактериального роста затем определяется путем визуального осмотра планшета. МИК теста на микроразбавление бульона определяют, когда при использовании определенного антибиотика рост не наблюдается. Преимущество этого теста в том, что одновременно можно тестировать более одного антибиотика. Недостатки заключаются в том, что разбавление бульона требует больших затрат труда и времени, а также могут возникать потенциальные процедурные ошибки.

Тест на разведение в агаровой среде аналогичен тесту на разведение в бульоне, главное отличие состоит в том, что в нем используются физические среды, а не жидкие среды.Разбавление агара выполняется путем помещения стандартных концентраций организма на чашки с агаром, которые различаются по концентрации антибиотика, как показано на рис. 64 МИК определяют в первой пробирке, которая не демонстрирует роста организма. Этот тест обычно используется при тестировании нескольких бактерий против определенного антибиотика. Разбавление агара также является трудоемким и требует много времени, и при этом нельзя тестировать более одного антибиотика за раз. 65

Комбинированное тестирование диффузии и разбавления

Е-тест — это количественный тест, сочетающий методы диффузии и разбавления. 64 Вместо диска в тесте используется тест-полоска E-test, содержащая антибиотик, который диффундирует через пластину с агаром, содержащую бактерии. Вдоль полоски имплантирован антибиотик различной концентрации (). В отличие от тестирования разбавления, различия в концентрации не отличаются друг от друга на одно разведение; вместо этого они расположены ближе друг к другу, что может обеспечить большую точность. После инкубации планшета в течение 24 часов зона ингибирования образует эллипс и пересекает полосу на планшете.Точка пересечения определяет значение MIC. E-тест является преимуществом, потому что стабильный градиент используется с более высоким посевом бактерий, что позволяет более точно считывать значения MIC. Недостатки в том, что на полосках можно тестировать только один антибиотик, а тест может быть дорогостоящим и трудоемким.

Автоматизированные системы

Преимущество автоматизированных систем состоит в том, что они менее трудозатратны и позволяют быстрее составлять отчеты о результатах. 66 Эти системы в основном используют принципы разведения для определения чувствительности к антибиотикам.Полностью автоматические системы вводят бактерии в панель, инкубируют их, затем считывают и интерпретируют результаты чувствительности. Автоматические тесты определяют МПК с помощью алгоритмов и позволяют создавать правила, предсказывающие устойчивость к другим антибиотикам. Кроме того, эти системы могут сохранять результаты для использования при создании антибиотиков вместе с другими отчетами. FDA устанавливает стандарты для утверждения автоматизированных систем, которые включают уровень ложной устойчивости менее 3% и ложной восприимчивости менее 1.5% на нижней границе 95% доверительного интервала (ДИ) и менее 7,5% на верхней границе 95% доверительного интервала. 67 Они также должны согласиться, в пределах одного разведения, на контрольную точку излома более чем в 90% случаев. Доступны различные автоматизированные системы, включая VITEK 2, Microscan Walkaway plus, Phoenix и Sensititre. Каждая система имеет множество панелей, которые тестируют разные бактерии и разные комбинации лекарств. Хотя ошибки могут возникать, это происходит на уровне комбинации лекарств и бактерий.Если ожидаются ошибки, результаты следует подтвердить ручным тестированием. Каждая система постоянно обновляется и может работать по-разному в зависимости от комбинации препарата и бактерий, что затрудняет рекомендацию одной системы по сравнению с другой.

In vitro по сравнению с In vivo Результаты

Антибиотики могут не дать излечения в клинических условиях ( in vivo, ), несмотря на демонстрацию чувствительности в лабораторных условиях ( in vitro, ). Это может происходить в результате механизмов резистентности, выработки токсинов или фармакокинетических и фармакодинамических свойств антибиотиков.Эта статья посвящена механизмам резистентности, и читатели могут обратиться к обзорам токсинов, фармакокинетики и фармакодинамики для получения дополнительной информации. 68 , 69 Резистентность может развиться во время лечения пациента антибиотиками; это было хорошо задокументировано с помощью клиндамицина. 70 D-тест на клиндамицин, использующий принцип дисковой диффузии, может помочь выявить индуцибельную устойчивость к клиндамицину у гемолитических стрептококков S. aureus и β .Для проведения теста диск, содержащий клиндамицин и эритромицин, помещают на тот же планшет и планшеты инкубируют. Если зона подавления отображается в виде круга, индуцируемого сопротивления нет; если он отображается как «D», имеется индуцируемое сопротивление.

По мере развития новых механизмов устойчивости лабораториям необходимо разработать новые способы обнаружения устойчивости. Одним из примеров этого является обнаружение бета-лактамазы расширенного спектра (ESBL) и / или бета-лактамазы AmpC. 71 , 72 БЛРС — это ферменты, расщепляющие многие бета-лактамные антибиотики, что делает их неэффективными.Они с большей вероятностью присутствуют в грамотрицательных бактериях, связанных с инфекциями, связанными со здоровьем. Для выявления БЛРС проводится скрининг путем тестирования определенных антибиотиков, таких как цефотаксим, с последующим добавлением клавулановой кислоты. Если скрининг БЛРС проводится с использованием микроразбавления бульона, сравнивается МПК между цефотаксимом и цефотаксимом плюс клавулановая кислота. Если при добавлении клавулановой кислоты наблюдается трехкратное изменение МИК при разведении, БЛРС присутствует. Например, если МИК составляет 2 мкг / мл для одного цефотаксима и снижается до 0.5 мкг / мл при добавлении клавулановой кислоты свидетельствует о наличии БЛРС. Интерпретация ESBL может быть дополнительно осложнена присутствием другой бета-лактамазы, AmpC. Это может вызвать ложноотрицательный скрининг на БЛРС, но его можно обнаружить с помощью Е-теста. В будущем, вероятно, будут выявлены новые механизмы резистентности, которые создадут новые проблемы в достижении клинического излечения.

% PDF-1.5 % 2 0 obj > эндобдж 15 0 объект >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 17 0 объект >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 1 0 объект >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 16 0 объект >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 19 0 объект >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 11 0 объект >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 21 0 объект >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 22 0 объект >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 14 0 объект >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 18 0 объект >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 13 0 объект >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 7 0 объект >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 9 0 объект >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 20 0 объект >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 8 0 объект >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 3 0 obj >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 24 0 объект >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 6 0 obj >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 12 0 объект >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 10 0 obj >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 4 0 obj >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 5 0 obj >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 23 0 объект >>> / BBox [0 0 792 612] / Длина 161 >> поток Икс 0E | $ & / iZYTp! \ 4 (; 9cb) 5AimO \ / ~ 9: Կ b; x5vc} y {2X @ c $ nK% + H | -n ـ v ؿ HlY «_5C конечный поток эндобдж 25 0 объект > поток 2018-08-29T12: 55: 47Z2016-03-30T16: 38: 05-04: 002018-08-29T12: 55: 47ZAcrobat PDFMaker 10.1 для Worduuid: 3dbaf81f-ebc8-47f2-bfbb-ee09dff0e00auuid: 874c6e75-0dac-498f-9714-746e40c6ee61

  • 4
  • application / pdf
  • Кевин Готье
  • Adobe PDF Library 10.0; изменено с помощью iText 2.1.7 пользователем 1T3XTD: 20160330173427Microsoft конечный поток эндобдж 26 0 объект > поток x + * T0T0

    Тестирование на чувствительность к противомикробным препаратам: обзор общих принципов и современной практики | Клинические инфекционные болезни

    Аннотация

    Важной задачей лаборатории клинической микробиологии является проведение испытаний на чувствительность к противомикробным препаратам значимых бактериальных изолятов.Цели тестирования — выявить возможную лекарственную устойчивость у распространенных патогенов и гарантировать чувствительность к препаратам выбора для конкретных инфекций. Наиболее широко используемые методы тестирования включают микроразбавление бульона или быстрые автоматизированные инструментальные методы, в которых используются коммерчески продаваемые материалы и устройства. Ручные методы, которые обеспечивают гибкость и возможную экономию затрат, включают методы диффузии по диску и градиентной диффузии. У каждого метода есть свои сильные и слабые стороны, в том числе организмы, которые могут быть точно протестированы этим методом.Некоторые методы обеспечивают количественные результаты (например, минимальную ингибирующую концентрацию), и все обеспечивают качественные оценки с использованием категорий чувствительности, промежуточности или устойчивости. В целом современные методы тестирования обеспечивают точное обнаружение общих механизмов устойчивости к противомикробным препаратам. Однако новые или появляющиеся механизмы устойчивости требуют постоянной бдительности в отношении способности каждого метода тестирования точно определять устойчивость.

    Появление устойчивости к противомикробным препаратам и обоснование для проведения тестирования на чувствительность

    Проведение испытаний на чувствительность к противомикробным препаратам в лаборатории клинической микробиологии важно для подтверждения чувствительности к выбранным эмпирическим антимикробным агентам или для выявления устойчивости у отдельных бактериальных изолятов.Эмпирическая терапия продолжает быть эффективной в отношении некоторых бактериальных патогенов, поскольку механизмы устойчивости не наблюдались, например, сохраняющаяся чувствительность к пенициллину Streptococcus pyogenes . Тестирование на чувствительность отдельных изолятов важно для видов, которые могут обладать механизмами приобретенной устойчивости (например, представители Enterobacteriaceae, виды Pseudomonas, видов Staphylococcus , виды Enterococcus и Streptococcus pneumoniae).

    Обзор широко используемых методов тестирования на чувствительность

    Тесты разбавления бульона. Одним из первых методов тестирования чувствительности к противомикробным препаратам был метод разведения макробротом или пробиркой [1]. Эта процедура включала приготовление двукратных разведений антибиотиков (например, 1, 2, 4, 8 и 16 мкг / мл) в жидкой питательной среде, разливаемой в пробирки [1, 2]. Пробирки с антибиотиками засевали стандартизированной бактериальной суспензией 1–5 × 10 5 КОЕ / мл.После инкубации в течение ночи при 35 ° C пробирки исследовали на предмет видимого роста бактерий, о чем свидетельствует помутнение. Самая низкая концентрация антибиотика, предотвращающая рост, представляет собой минимальную ингибирующую концентрацию (МИК). Считалось, что точность этого метода составляет плюс-минус 1 двукратная концентрация, в значительной степени из-за практики ручного приготовления серийных разведений антибиотиков [3]. Достоинством этого метода было получение количественного результата (т. Е. MIC).Основными недостатками метода макроразведения были утомительная ручная работа по приготовлению растворов антибиотиков для каждого теста, возможность ошибок при приготовлении растворов антибиотиков, а также относительно большое количество реагентов и пространство, необходимое для каждого теста.

    Миниатюризация и механизация теста за счет использования небольших одноразовых пластиковых лотков для «микроразведения» (рис. 1) сделали тестирование разбавления бульона практичным и популярным. Стандартные лотки содержат 96 лунок, каждая объемом 0 мкл.1 мл, что позволяет протестировать примерно 12 антибиотиков в 8 двукратных разведениях в одном лотке [2, 4]. Панели для микроразведений обычно готовятся с использованием дозирующих инструментов, которые распределяют точные объемы предварительно взвешенных и разведенных антибиотиков в бульоне в отдельные лунки лотков из сосудов большого объема. Сотни идентичных тарелок можно приготовить из одного основного набора разведений за относительно короткий период. Некоторые лаборатории клинической микробиологии готовят свои собственные панели; вместо этого замороженные или высушенные панели для микроразведения приобретаются у одного из нескольких коммерческих поставщиков.Стоимость готовых панелей составляет примерно от 10 до 22 долларов каждая. Инокуляция панелей стандартом 5 × 10 5 КОЕ / мл осуществляется с помощью одноразового устройства, которое переносит 0,01–0,05 мл стандартизированной бактериальной суспензии в каждую лунку лотка для микроразведений или с помощью механизированного дозатора. После инкубации МИК определяют с помощью ручного или автоматического устройства просмотра для проверки каждой лунки панели на предмет роста [2].

    Рисунок 1

    Панель чувствительности к микроразбавлению бульона, содержащая 98 лунок с реагентами и одноразовый посевной лоток

    Рисунок 1

    Панель чувствительности к микроразведению бульона, содержащая 98 лунок с реагентами и одноразовый посевной лоток

    МИК, воспроизводимость и удобство заранее приготовленных панелей, а также экономия реагентов и пространства, которая достигается за счет миниатюризации теста.Также оказывается помощь в создании компьютеризированных отчетов, если используется автоматический считыватель панелей. Основным недостатком метода микроразведения является некоторая негибкость выбора лекарств, доступных в стандартных коммерческих панелях.

    Антимикробный градиентный метод. Метод диффузии в градиенте антимикробных препаратов использует принцип установления градиента концентрации противомикробных препаратов в агаризованной среде как средство определения чувствительности. Etest (bioMérieux AB BIODISK) (рис. 2) — это коммерческая версия, доступная в США.В нем используются тонкие пластиковые тест-полоски, которые пропитаны с нижней стороны градиентом концентрации высушенного антибиотика и отмечены на верхней поверхности шкалой концентрации. До 5 или 6 полосок могут быть размещены радиально на поверхности соответствующей 150-миллиметровой чашки с агаром, засеянной стандартизированной суспензией организмов, подобной той, которая используется для теста диффузии на дисках. После инкубации в течение ночи тесты считываются, просматривая полоски сверху планшета. MIC определяется пересечением нижней части эллиптической зоны ингибирования роста с тест-полоской.

    Рисунок 2

    Изолят Staphylococcus aureus протестирован методом градиентной диффузии Etest с ванкомицином (VA), даптомицином (DM) и линезолидом (LZ) на агаре Мюллера-Хинтона. Минимальная ингибирующая концентрация каждого агента определяется пересечением роста микроорганизмов с полоской при измерении с использованием шкалы, нанесенной на полоску.

    Рисунок 2

    Изолят Staphylococcus aureus протестирован методом градиентной диффузии Etest с ванкомицином (VA), даптомицином (DM) и линезолидом (LZ) на агаре Мюллера-Хинтона.Минимальная ингибирующая концентрация каждого агента определяется пересечением роста микроорганизмов с полоской при измерении с использованием шкалы, нанесенной на полоску.

    Метод градиентной диффузии обладает внутренней гибкостью, поскольку позволяет тестировать лекарственные препараты, выбранные лабораторией. Полоски Etest стоят примерно 2–3 доллара каждая и могут представлять собой дорогостоящий подход, если тестируется несколько препаратов. Этот метод лучше всего подходит для ситуаций, в которых необходим МИК только для 1 или 2 препаратов или когда нужно тестировать требовательный организм, требующий обогащенной среды или специальной инкубационной атмосферы (например, пенициллин и цефтриаксон с пневмококками) [5-7].Как правило, результаты Etest хорошо коррелируют с MIC, полученными с помощью методов разбавления в бульоне или агаре [5-9]. Однако существуют некоторые систематические предубеждения в сторону более высоких или более низких значений MIC, определяемых Etest при тестировании определенных комбинаций организм-противомикробный агент [6, 10]. Это может представлять собой потенциальный недостаток, когда стандартные критерии интерпретации МИК, полученные в результате тестирования разбавления бульона [10], применяются к МИК Etest, которые могут быть не идентичными.

    Тест диффузии диска. Метод дисковой диффузионной восприимчивости [2, 11, 12] прост, практичен и хорошо стандартизирован.Тест выполняется путем нанесения бактериального посевного материала приблизительно 1-2 × 10 8 КОЕ / мл на поверхность большой (диаметром 150 мм) чашки с агаром Мюллера-Хинтона. На засеянную поверхность агара помещают до 12 коммерческих бумажных дисков с фиксированной концентрацией антибиотиков (рис. 3). Планшеты инкубируют в течение 16–24 ч при 35 ° C перед определением результатов. Зоны задержки роста вокруг каждого диска с антибиотиком измеряются с точностью до миллиметра. Диаметр зоны зависит от восприимчивости изолята и скорости диффузии лекарственного средства через агаровую среду.Диаметр зоны каждого препарата интерпретируется с использованием критериев, опубликованных Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI, ранее Национальный комитет клинических лабораторных стандартов или NCCLS) [13] или критериями, включенными в Управление по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) — утвержденные товарные вкладыши для дисков. Результаты диско-диффузионного теста являются «качественными» в том смысле, что категория восприимчивости (т. Е. Чувствительная, промежуточная или устойчивая) определяется тестом, а не МПК.Однако некоторые коммерчески доступные системы считывания зон заявляют, что рассчитывают приблизительный МПК для некоторых организмов и антибиотиков путем сравнения размеров зон со стандартными кривыми этого вида и лекарства, хранящимися в алгоритме [14, 15].

    Рисунок 3

    Диско-диффузионный тест с изолятом Escherichia coli из посевов мочи. Диаметр всех зон ингибирования измеряется, и эти значения переводятся в категории восприимчивых, промежуточных или устойчивых с использованием последних таблиц, опубликованных CLSI.

    Рис. 3

    Диско-диффузионный тест с изолятом Escherichia coli из посевов мочи. Диаметр всех зон ингибирования измеряется, и эти значения переводятся в категории восприимчивых, промежуточных или устойчивых с использованием последних таблиц, опубликованных CLSI.

    Преимуществами дискового метода являются простота тестирования, не требующая специального оборудования, предоставление категориальных результатов, легко интерпретируемых всеми клиницистами, и гибкость в выборе дисков для тестирования.Это наименее затратный из всех методов определения чувствительности (примерно 2,50–5 долларов за тест для материалов). К недостаткам теста дисков можно отнести отсутствие механизации или автоматизации теста. Хотя не все привередливые или медленно растущие бактерии могут быть точно протестированы этим методом, дисковый тест стандартизирован для тестирования стрептококков, Haemophilus influenzae и N. meningitidis с использованием специализированных сред, условий инкубации и определенного размера зоны. критерии интерпретации [12].

    Автоматизированные приборные системы. Использование инструментов может стандартизировать считывание конечных точек и часто дает результаты теста на чувствительность за более короткий период, чем ручное считывание, потому что чувствительные оптические системы обнаружения позволяют обнаруживать незначительные изменения в росте бактерий. В настоящее время FDA разрешает использовать 4 автоматизированных прибора в США. Три из них могут дать быстрые (3,5–16 ч) результаты теста на чувствительность, а четвертый — ночная система [16].MicroScan WalkAway (Siemens Healthcare Diagnostics) — это большой автономный инкубатор / считывающее устройство, которое может инкубировать и анализировать 40–96 лотков для микроразведений. В WalkAway используются лотки для микроразведений стандартного размера, которые гидратируются и инокулируются вручную, а затем помещаются в одно из гнезд инкубатора в приборе. Прибор инкубирует лотки в течение соответствующего периода, периодически исследуя их с помощью фотометра или флуорометра для определения развития роста. Тестовые панели грамотрицательной чувствительности, содержащие флуорогенные субстраты, можно прочитать в 3.5–7 ч. Отдельные грамположительные и грамотрицательные панели, считываемые с использованием турбидиметрических конечных точек, готовы через 4,5–18 часов.

    Автоматизированная микробиологическая система BD Phoenix Automated Microbiology System (BD Diagnostics) оснащена большим считывающим устройством-инкубатором, способным обрабатывать 99 тестовых панелей, которые содержат 84 лунки, предназначенные для двойных разведений антибиотиков, и засеваются вручную. Phoenix контролирует каждую панель каждые 20 минут, используя как турбидометрическое, так и колориметрическое (индикатор окисления-восстановления) определение роста. Тест-панели на грамотрицательные, грамположительные, S.pneumoniae , β-гемолитики и стрептококки группы viridans. Результаты МИК получают через 6–16 часов.

    Система Vitek 2 (bioMérieux) высоко автоматизирована и использует очень компактные пластиковые карточки с реагентами (размером с кредитную карту), которые содержат микролитровые количества антибиотиков и тестовые среды в 64-луночном формате. Vitek 2 использует повторяющийся турбидиметрический мониторинг роста бактерий в течение сокращенного инкубационного периода. Прибор можно настроить на одновременное выполнение 30–240 тестов.Карты восприимчивости позволяют проводить тестирование на обычные, быстрорастущие грамположительные и грамотрицательные аэробные бактерии, а также на S. pneumoniae в течение 4–10 часов. Более старая, менее автоматизированная система Vitek 1 до сих пор используется в некоторых лабораториях. Система более ограничена 45-луночной картой и не включает S. pneumoniae .

    Sensititre ARIS 2X (Trek Diagnostic Systems) — это автоматизированная система инкубации и считывания в ночное время с 64 панелями. Тестовые панели представляют собой стандартные 96-луночные планшеты для микроразведения, которые можно засеять с помощью автоинкулятора Sensititre.Рост определяется измерением флуоресценции через 18–24 ч инкубации. Доступны тестовые панели для грамположительных и грамотрицательных бактерий, видов S. pneumoniae , Haemophilus и неферментативных грамотрицательных бацилл.

    Приборы Phoenix, Sensititre ARIS 2X, Vitek 1 и 2 и WalkAway содержат усовершенствованное компьютерное программное обеспечение, используемое для интерпретации результатов восприимчивости, включая «экспертные системы» для анализа результатов тестов на атипичные образцы и необычные фенотипы устойчивости [16].Два исследования [17, 18] показали, что предоставление быстрых результатов теста на чувствительность может привести к более своевременным изменениям в соответствующей противомикробной терапии, значительной прямой экономии затрат, связанной с заказом меньшего количества дополнительных лабораторных тестов, выполнением меньшего количества инвазивных процедур и сокращением продолжительности лечения. оставаться. Эти преимущества лучше всего реализуются в сочетании с расширенным графиком укомплектования персоналом лаборатории и электронной передачей проверенных результатов в режиме реального времени. Одним из первых недостатков быстрых методов тестирования на чувствительность была ограниченная способность выявлять некоторые типы устойчивости к противомикробным препаратам, включая индуцибельные β-лактамазы и устойчивость к ванкомицину.Тем не менее, инструменты, недавно одобренные FDA, значительно улучшились в значительной степени за счет модификации компьютерного программного обеспечения инструментов для обеспечения расширенной инкубации проблемных комбинаций организм-лекарство или путем редактирования результатов чувствительности с использованием экспертного программного обеспечения для предотвращения получения маловероятных результатов. сообщил. В некоторых случаях эти модификации приводят к длительной инкубации (т.е.> 10 ч) тестовых панелей для обеспечения точных результатов, что делает их менее «быстрыми».”

    Выбор препаратов для стандартного тестирования

    Лаборатория должна протестировать и сообщить о противомикробных средствах, которые наиболее подходят для изолированного организма, для очага инфекции и формуляра учреждения [13, 19]. CLSI предоставляет таблицы, в которых перечислены противомикробные агенты, подходящие для тестирования представителей Enterobacteriaceae, Pseudomonas и других грамотрицательных неферментеров глюкозы, стафилококков, энтерококков, стрептококков, видов Haemophilus и т. Д.[13]. Списки включают рекомендации для агентов, которые важно тестировать в плановом порядке, и тех, которые могут тестироваться или о которых можно сообщить выборочно на основе формуляра учреждения.

    Затем необходимо определить доступность противомикробных агентов для тестирования по стандартной лабораторной методике тестирования. Процедуры дисковой диффузии и градиентной диффузии обеспечивают максимальную гибкость, включая тестирование новых доступных лекарств. Большинство панелей для микроразведений бульонов или автоматизированных тестовых панелей содержат ≤96 лунок, что эффективно ограничивает количество тестируемых агентов или диапазон разведений каждого лекарства, которое может быть включено.Производители коммерчески приготовленных панелей пытались решить эту проблему, предлагая ряд различных стандартных конфигураций панелей или путем включения меньшего количества разведений каждого лекарства в одну панель [19]. Другим решением этой проблемы является тестирование противомикробных агентов, которые имеют активность, по существу, такую ​​же, как у желаемых лекарственных препаратов. В документе о тестировании чувствительности CLSI [13] перечислены группы некоторых противомикробных агентов с почти идентичной активностью, которые могут предоставить практические альтернативы для тестирования.

    Интерпретация результатов теста на чувствительность

    Результаты теста на чувствительность должны интерпретироваться лабораторией до передачи отчета врачу пациента. Оптимальная интерпретация МИК требует знания фармакокинетики препарата у людей и информации о вероятном успехе конкретного препарата в уничтожении бактерий на различных участках тела [20]. Лучше всего это сделать, обратившись к экспертному источнику, например, CLSI, который публикует критерии интерпретации МИК всех соответствующих антибиотиков для большинства родов бактерий [13].Действительно, и значения МИК, и диаметры дисковых диффузионных зон должны интерпретироваться с использованием таблицы значений, которые относятся к доказанной клинической эффективности каждого антибиотика и для различных видов бактерий [12]. Размер зоны CLSI и критерии интерпретации МИК устанавливаются путем анализа трех видов данных: (1.) микробиологических данных, включая сравнение МИК и размеров зон на большом количестве бактериальных штаммов, включая штаммы с известными механизмами устойчивости, которые имеют были определены фенотипически или генотипически; (2) фармакокинетические и фармакодинамические данные; и (3) результаты клинических исследований (включая сравнение МПК и диаметра зоны с микробиологической эрадикацией и клинической эффективностью), полученные в ходе исследований до утверждения FDA и продажи антибиотика [20].

    Результат «чувствительность» указывает на то, что организм пациента должен реагировать на терапию этим антибиотиком, используя дозировку, обычно рекомендованную для данного типа инфекции и вида [13, 20]. И наоборот, организм с МПК или размером зоны, интерпретируемым как «устойчивый», не должен подавляться концентрациями антибиотика, достигаемыми с дозировками, обычно используемыми с этим лекарством [13, 20]. «Промежуточный» результат указывает на то, что микроорганизм попадает в диапазон чувствительности, в котором МПК приближается или превышает уровень антибиотика, который обычно может быть достигнут, и для которого клинический ответ, вероятно, будет меньше, чем для чувствительного штамма.Исключения могут иметь место, если антибиотик высококонцентрирован в жидкости организма, такой как моча, или если можно безопасно вводить более высокие, чем обычно, дозы антибиотика (например, некоторые пенициллины и цефалоспорины). Иногда «промежуточный» результат также может означать, что некоторые переменные в тесте на чувствительность не контролировались должным образом, и что значения попали в «буферную зону», отделяющую восприимчивые от устойчивых штаммов [13, 20]. Как правило, сообщение о результате категории «чувствительный», «промежуточный» или «устойчивый» предоставляет клиницисту информацию, необходимую для выбора соответствующей терапии.Отчет о МПК может помочь врачу выбрать из группы аналогичных препаратов для лечения инфекционного эндокардита или остеомиелита, лечение которых, вероятно, будет продолжительным.

    Важно, чтобы таблицы, используемые для интерпретации тестов на восприимчивость, отражали самые актуальные критерии. Действительно, документы CLSI часто пересматриваются и обновляются, обычно один раз в год. Использование старой или устаревшей информации из исходных изданий одобренных FDA этикеток лекарств или старых таблиц CLSI может представлять собой серьезный недостаток в отчетности о результатах пациентов.

    Какова допустимая точность метода проверки чувствительности?

    При оценке точности различных методов тестирования чувствительности по сравнению со стандартными эталонными методами, термины очень серьезные и серьезные ошибки использовались для описания ложно-чувствительных или ложно-устойчивых результатов, соответственно. При оценке новых методов тестирования чувствительности важно изучить репрезентативное количество штаммов, устойчивых к различным лекарствам, чтобы проверить способность нового теста выявлять резистентность, и протестировать ряд чувствительных штаммов, чтобы определить частоту серьезных ошибок, которые можно ожидать в типичных клинических лабораторных условиях [16, 21].Чтобы получить разрешение на продажу в Соединенных Штатах, FDA требует, чтобы очень серьезные ошибки, относящиеся к тестируемому устройству, были <1,5% для сравнения отдельных видов / лекарств, основные ошибки не должны превышать 3%, а общее обязательное соглашение по MIC> 90% МИК устройств в пределах одного двойного разведения эталонного МИК CLSI [22]. Недавний международный стандарт оценки устройств для тестирования чувствительности предлагает аналогичные, но не идентичные критерии приемлемой точности [23]. Появление новых механизмов устойчивости к противомикробным препаратам, включая те, которые трудно обнаружить (например, промежуточная чувствительность к ванкомицину у S.aureus и производство карбапенемазы у некоторых грамотрицательных организмов) требует, чтобы характеристики устройств для определения чувствительности постоянно пересматривались и обновлялись по мере необходимости. В некоторых случаях было необходимо использовать специальные вспомогательные методы тестирования (например, скрининговые агары с однократной концентрацией, модифицированный тест Ходжа на продукцию карбапенемазы) [13], чтобы дополнить рутинное тестирование с помощью коммерческой инструментальной системы.

    Текущие методы испытаний и будущие направления

    Методы тестирования чувствительности к противомикробным препаратам, описанные в этой статье, обеспечивают надежные результаты при использовании в соответствии с процедурами, определенными CLSI или производителями коммерческих продуктов.Однако есть значительные возможности для улучшения в области быстрого и точного распознавания устойчивости бактерий к антибиотикам. Существует потребность в разработке новых автоматизированных инструментов, которые могли бы обеспечить более быстрые результаты, а также сэкономить деньги за счет более низких затрат на реагенты и меньших трудозатрат. Для этого, вероятно, потребуется изучить различные методологические подходы к обнаружению роста бактерий. Прямое обнаружение генов устойчивости с помощью полимеразной цепной реакции или аналогичных методов имеет ограниченную полезность, потому что только несколько генов устойчивости прочно связаны с фенотипической устойчивостью (например, mecA, vanA и vanB ) [24].Существуют сотни β-лактамаз и многочисленные мутации, приобретения и механизмы экспрессии, которые приводят к устойчивости к фторхинолонам, аминогликозидам и макролидам [25]; слишком много, чтобы их можно было легко обнаружить с помощью современных молекулярных методов. Таким образом, представляется вероятным, что фенотипические измерения уровня чувствительности бактериальных изолятов к противомикробным агентам будут оставаться клинически значимыми в ближайшие годы.

    Благодарности

    Возможный конфликт интересов. J.H.J. и M.J.F. раскрыть свое членство в консультативных комитетах по микробиологии компаний BD Diagnostics и bioMérieux. J.H.J. консультировал Accelr8 Technology и получил исследовательскую поддержку от BD Diagnostics, bioMérieux, Merck, Pfizer и Siemens Healthcare.

    Список литературы

    1,.

    Тестирование чувствительности к антибиотикам: отчет международного совместного исследования

    ,

    Acta Pathol Microbiol Scand

    ,

    1971

    , vol.

    217

    Доп.

    (стр.

    1

    90

    ) 2,. ,,,,.

    Тесты на чувствительность к антибактериальным препаратам: методы разведения и дисковой диффузии

    ,

    Руководство клинического микробиолога

    ,

    2007

    9-е изд.

    Вашингтон, округ Колумбия

    Американское общество микробиологов

    (стр.

    1152

    72

    ) 3. ,

    Современные методы тестирования чувствительности к антибиотикам

    ,

    1972

    Springfield, IL

    Charles C. Thomas

    4

    Институт клинических и лабораторных стандартов

    ,

    Методы исследования чувствительности к противомикробным препаратам при разведении бактерий, которые росли в аэробных условиях.Утвержденный стандарт M7-A10

    ,

    2009

    Wayne, PA

    Институт клинических и лабораторных стандартов

    5,,,.

    Точность теста E для определения антимикробной чувствительности стафилококков, энтерококков, Campylobacter jejuni и грамотрицательных бактерий, устойчивых к антимикробным агентам

    ,

    J Clin Microbiol

    ,

    1992

    , vol.

    30

    (стр.

    3243

    8

    ) 6,,,,,.

    Выявление устойчивости к пенициллину и цефалоспоринам расширенного спектра среди клинических изолятов Streptococcus pneumoniae с использованием теста E

    ,

    J Clin Microbiol

    ,

    1994

    , vol.

    32

    (стр.

    159

    63

    ) 7,,,.

    Оценка теста E для определения чувствительности анаэробных бактерий

    ,

    J Clin Microbiol

    ,

    1991

    , vol.

    29

    (стр.

    2197

    203

    ) 8,,,.

    Сравнение метода Е-теста с разведением в агаре, микроразведением бульона и методами тестирования чувствительности к диффузии в агаре с использованием специального набора бактерий

    ,

    J Clin Microbiol

    ,

    1991

    , vol.

    29

    (стр.

    533

    8

    ) 9,,.

    Сравнение Oxoid M.I.C. Устройство для оценки с микроразбавлением бульона и тестовым устройством E от AB Biodisk для тестирования энтеробактерий на чувствительность к противомикробным препаратам [аннотация P859]

    ,

    Программа и выдержки 18-го ежегодного собрания Европейского конгресса по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Барселона). Европейский конгресс по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям

    ,

    2008

    10,,.

    МИК ванкомицина для метициллин-устойчивых изолятов Staphylococcus aureus (MRSA) различается в зависимости от используемого метода теста на чувствительность

    ,

    Противомикробные агенты Chemother

    ,

    2008

    , vol.

    52

    стр.

    4528

    11,,,.

    Определение чувствительности к антибиотикам стандартным методом с одним диском

    ,

    Am J Clin Pathol

    ,

    1966

    , vol.

    45

    (стр.

    493

    6

    ) 12

    Институт клинических и лабораторных стандартов

    ,

    Стандарты эффективности тестов на чувствительность дисков к антимикробным препаратам.Утвержденный стандарт M2-A10

    ,

    2009

    Wayne, PA

    Институт клинических и лабораторных стандартов

    13

    Институт клинических и лабораторных стандартов

    ,

    Стандарты эффективности тестирования чувствительности к противомикробным препаратам. Девятнадцатое информационное приложение M100-S19

    ,

    2009

    Wayne, PA

    Институт клинических и лабораторных стандартов

    14,.

    Оценка видео-ридера BIOMIC для определения интерпретируемых категорий изолятов на основе результатов диско-диффузионной чувствительности

    ,

    J Clin Microbiol

    ,

    1998

    , vol.

    36

    (стр.

    302

    4

    ) 15,,,,,.

    Сравнение и оценка систем чувствительности к противомикробным препаратам Osiris и Sirscan 2000 в лаборатории клинической микробиологии

    ,

    J Clin Microbiol

    ,

    2003

    , vol.

    41

    (стр.

    3627

    30

    ) 16,. ,,,,.

    Приборы для тестирования чувствительности и компьютеризированные экспертные системы для анализа и интерпретации данных

    ,

    Руководство по клинической микробиологии 9-е изд

    ,

    2007

    Вашингтон, округ Колумбия

    Американское общество микробиологии

    (стр.

    245

    56

    ) 17,,,.

    Клиническое влияние экспресс-тестирования чувствительности in vitro и идентификации бактерий

    ,

    J Clin Microbiol

    ,

    1994

    , vol.

    32

    (стр.

    1757

    62

    ) 18,,.

    Клинические и финансовые преимущества быстрой идентификации бактерий и определения чувствительности к противомикробным препаратам

    ,

    J Clin Microbiol

    ,

    1999

    , vol.

    37

    (стр.

    1415

    8

    ) 19.

    Выбор противомикробных препаратов для рутинного тестирования в лаборатории клинической микробиологии

    ,

    Diagn Microbiol Infect Dis

    ,

    1993

    , vol.

    16

    (стр.

    245

    9

    ) 20

    Институт клинических и лабораторных стандартов

    Разработка критериев чувствительности in vitro и параметров контроля качества; утвержденное руководство

    ,

    Документ CLSI M23-A

    ,

    2008

    3-е изд.

    Wayne, PA

    Институт клинических и лабораторных стандартов

    21.

    Критерии выбора системы тестирования чувствительности к противомикробным препаратам

    ,

    J Clin Microbiol

    ,

    1993

    , vol.

    31

    (стр.

    2841

    4

    ) 22

    Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США

    ,

    Руководство по специальным мерам контроля класса II: системы испытаний на чувствительность к противомикробным препаратам (AST); руководство для промышленности и FDA

    ,

    2003

    Rockville, MD

    Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США

    23

    Международная организация по стандартизации

    ,

    Системы клинического лабораторного тестирования и диагностики in vitro — тестирование чувствительности к инфекционным агентам и оценка эффективности устройств для определения чувствительности к противомикробным препаратам.Часть 2: оценка эффективности устройств для определения чувствительности к противомикробным препаратам. ISO 20776-2

    ,

    2007

    Женева

    Международная организация по стандартизации

    24.

    ДНК-зонды для тестирования чувствительности к противомикробным препаратам

    ,

    Clin Lab Med

    ,

    1989

    , vol.

    9

    (стр.

    341

    7

    ) 25,. ,,,,.

    Механизмы устойчивости к антибактериальным агентам

    ,

    Руководство по клинической микробиологии 9-е изд

    ,

    2007

    Вашингтон, округ Колумбия

    Американское общество микробиологии

    (стр.

    1114

    45

    )

    © 2009 Американского общества инфекционистов

    Измерение чувствительности к лекарствам | Безграничная микробиология

    Минимальная ингибирующая концентрация (МИК)

    Минимальная ингибирующая концентрация — это самая низкая концентрация лекарственного средства, которая предотвращает видимый рост микроорганизмов после инкубации в течение ночи.

    Цели обучения

    Анализ данных для интерпретации значений минимальной ингибирующей концентрации

    Ключевые выводы

    Ключевые моменты
    • Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) можно определить путем культивирования микроорганизмов в жидкой среде или на чашках с твердой питательной средой.
    • Более низкое значение MIC указывает на то, что для подавления роста организма требуется меньше лекарственного средства; следовательно, препараты с более низкими показателями МПК являются более эффективными противомикробными средствами.
    • Путем определения подходящих лекарств и их эффективных концентраций, показатели MIC помогают улучшить результаты для пациентов и предотвратить развитие устойчивых к лекарствам штаммов микробов.
    Ключевые термины
    • культура : Процесс выращивания бактерии или другого биологического объекта в искусственной среде.
    • минимальная ингибирующая концентрация : это самая низкая концентрация противомикробного препарата, предотвращающего видимый рост микроорганизмов после инкубации со средой в течение ночи.
    • бактериостатический : препарат, который предотвращает рост и размножение бактерий, но не обязательно убивает их. Когда его удаляют из окружающей среды, бактерии снова начинают расти.

    Определение и измерение

    В микробиологии минимальная ингибирующая концентрация (МИК) — это самая низкая концентрация противомикробного (например, противогрибкового, антибиотического или бактериостатического) препарата, который подавляет видимый рост микроорганизма после инкубации в течение ночи.МИК могут быть определены на чашках с твердой питательной средой (называемой агаром, показанной в атоме «Тест на чувствительность к диску Кирби-Бауэра») или методами разбавления бульона (в жидкой питательной среде, показанной на рисунке) после выделения чистой культуры. Например, для определения МПК посредством разбавления бульона идентичные дозы бактерий культивируют в лунках с жидкой средой, содержащей постепенно более низкие концентрации лекарственного средства. Минимальная ингибирующая концентрация антибиотика находится между концентрациями в последней лунке, в которой бактерии не росли, и следующей более низкой дозой, которая позволила бактериям расти.Есть также несколько доступных коммерческих методов для экспериментального измерения значений MIC.

    Метод разведения микробов : Чтобы определить минимальную концентрацию, необходимую для данного антибиотика для подавления роста бактерий, идентичное количество бактерий вводят в лунки с жидкой средой, содержащей постепенно более низкие концентрации лекарственного средства. (Здесь последовательность разведения лекарства установлена ​​слева направо: например, лунка E1 может содержать 100 единиц лекарства; E2, 50 единиц; E3, 25 единиц; E4, 12.5 единиц; так далее.). Поскольку рост бактерий сделал среду в лунке E5 мутной, а среда в лунке E4 неотличима от прозрачной среды, это указывает на то, что минимальная ингибирующая концентрация находится между концентрациями лекарственного средства в лунках E4 и E5. (Изображение любезно предоставлено Microrao, Департамент микробиологии, JJMMC, Давангере).

    Значение и применение

    МИК обычно считается самым основным лабораторным измерением активности противомикробного агента против организма.Поскольку более низкое значение МИК указывает на то, что для подавления роста организма требуется меньше лекарственного средства, лекарства с более низкими показателями МИК являются более эффективными противомикробными средствами. В настоящее время существует несколько баз данных MIC в свободном доступе в Интернете. Показатели MIC важны в диагностических лабораториях для подтверждения устойчивости микроорганизмов к противомикробным препаратам, а также для мониторинга активности новых противомикробных агентов. Клиницисты используют шкалу MIC, чтобы выбрать, какие антибиотики вводить пациентам с конкретными инфекциями, и определить эффективную дозу антибиотика.Это важно, потому что у популяций бактерий, подвергшихся воздействию недостаточной концентрации определенного лекарства или антибиотика широкого спектра действия (который предназначен для подавления многих штаммов бактерий), может развиться устойчивость к этим лекарствам. Таким образом, показатели MIC помогают улучшить исходы для пациентов и предотвратить развитие устойчивых к лекарствам штаммов микробов.

    Тест восприимчивости к диску Кирби-Бауэра

    Тестирование Кирби-Бауэра измеряет чувствительность бактерий к антибиотикам путем культивирования бактерий на твердых питательных средах, окружающих источники лекарства.

    Цели обучения

    Обзор процедуры теста на антибиотики Кирби-Бауэра

    Ключевые выводы

    Ключевые моменты
    Тесты
    • KB выполняются в стандартных условиях, поэтому минимальную ингибирующую концентрацию для данного антибиотика можно рассчитать путем сравнения наблюдаемого размера зоны ингибирования с известными значениями.
    • Клиницисты используют результаты теста KB для выбора антибиотиков, эффективных против конкретных бактерий, вызывающих инфекцию пациента.Использование целенаправленных антибиотиков помогает снизить частоту развития устойчивых к лекарствам бактерий.
    Ключевые термины
    • Тестирование антибиотиков по Кирби-Бауэру : это метод определения чувствительности микроорганизмов к определенным антимикробным препаратам; более высокая эффективность лекарственного средства дает более крупные зоны, свободные от микробов, окружающие диски, содержащие лекарственное средство, после роста в течение ночи на твердой среде.
    • зона подавления : Это область среды, где бактерии не могут расти из-за присутствия лекарства, препятствующего их росту.
    • минимальная ингибирующая концентрация : это самая низкая концентрация противомикробного препарата, предотвращающего видимый рост микроорганизмов после инкубации со средой в течение ночи.

    Тестирование антибиотиков по Кирби-Бауэру (также называемое тестированием КБ или диско-диффузионным тестированием чувствительности к антибиотикам) использует пластины или диски, содержащие антибиотики, для проверки чувствительности определенных бактерий к определенным антибиотикам. Сначала от пациента выделяют чистую культуру бактерий.Затем известное количество бактерий выращивают в течение ночи на чашках с агаром (твердой питательной средой) в присутствии тонкой пластины, содержащей известное количество соответствующего антибиотика. Если бактерии восприимчивы к определенному антибиотику из пластины, пластина окружает область прозрачной среды, где бактерии не могут расти, что называется зоной ингибирования. Большая зона ингибирования вокруг диска, содержащего антибиотик, указывает на то, что бактерии более чувствительны к антибиотику в диске.

    Тест Кирби-Бауэра : В тесте Кирби-Бауэра диски, содержащие антибиотики, помещаются на агар, где растут бактерии, и антибиотики диффундируют в агар. Если антибиотик останавливает рост бактерий, можно увидеть круглые области вокруг пластин, на которых бактерии не выросли.

    Тесты размером

    КБ выполняются в стандартных условиях, и для каждого антибиотика установлены зоны ингибирования стандартного размера. Результаты теста KB обычно указываются как чувствительные, промежуточные или устойчивые в зависимости от размера зоны ингибирования.Если наблюдаемая зона ингибирования больше или равна размеру стандартной зоны, микроорганизм считается чувствительным к антибиотику. И наоборот, если наблюдаемая зона ингибирования меньше стандартного размера, микроорганизм считается устойчивым. Размер зоны ингибирования в тесте KB обратно пропорционален минимальной ингибирующей концентрации (MIC), которая представляет собой количество антибиотика, необходимое для предотвращения роста бактерий в ночной культуре.МИК (в мкг / мл) можно рассчитать из известных графиков стандартной кривой (линейная регрессия) на основании диаметра наблюдаемого диаметра зоны ингибирования (в миллиметрах).

    Клиницисты могут использовать результаты теста KB для выбора подходящих антибиотиков для борьбы с определенной инфекцией у пациента. Введение антибиотиков, которые нацелены на конкретные бактерии, вызывающие инфекцию, позволяет избежать использования антибиотиков широкого спектра действия, нацеленных на многие типы бактерий. Таким образом, клиническое применение результатов тестирования KB может снизить частоту эволюции устойчивых к антибиотикам бактерий.

    Тестирование чувствительности к антибиотикам | Лабораторные тесты онлайн

    Источники, использованные в текущем обзоре

    Street, T. (Обновлено 13 марта 2014 г.). Чувствительность к противомикробным препаратам. Medscape. Доступно в Интернете по адресу https://emedicine.medscape.com/article/2103786-overview?pa=rOBA1lN0uZhjg0bJO6bD2AgpF2o0ma5fK6AeuJMPuepOQ4%2B%2BoTWGQm%2Be5C543B%2BoTWGQm%2Be5C543B%2BoTWGQm%2Be5C543B%2BOTWGQm%2Be5c5z2mUj2 По состоянию на апрель 2018 г.

    Arena, F. et al. (2015). Тестирование на чувствительность к антибиотикам: настоящее и будущее.Medscape. Доступно на сайте https://www.medscape.com/viewarticle/851528_1. По состоянию на апрель 2018 г.

    Григоренко Э. и Сталонс Д. Р. (5 октября 2016 г.). Устранение устойчивости к антибиотикам с помощью молекулярной диагностики. Клинические лабораторные продукты. Доступно на сайте http://www.clpmag.com/2016/10/addressing-antibiotic-resistance-molecular-diagnostics/. По состоянию на апрель 2018 г.

    Syal, K. et al. (2017). Текущие и новые методы тестов на чувствительность к антибиотикам. Доступно в Интернете по адресу https: // www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5479269/. По состоянию на апрель 2018 г.

    Vorvick, L.J. (проверено 26 января 2017 г.). Анализ чувствительности. MedlinePlus. Доступно на сайте https://medlineplus.gov/ency/article/003741.htm. По состоянию на апрель 2018 г.

    Maurer, F. P. et al. (30 марта 2017 г.). Достижения в быстрой идентификации и тестировании на чувствительность бактерий в лаборатории клинкальной микробиологии: значение для ухода за пациентами и программы управления антимикробными препаратами. Отчеты об инфекционных заболеваниях. Доступно на сайте https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5391540/. По состоянию на апрель 2018 г.

    (обновлено 7 декабря 2017 г.). Вопросы и ответы об устойчивости к антибиотикам. Центры по контролю и профилактике заболеваний. Доступно в Интернете по адресу https://www.cdc.gov/antibiotic-use/community/about/antibiotic-resistance-faqs.html. По состоянию на апрель 2018 г.

    (© 1995-2018). Чувствительность к противомикробным препаратам, анаэробные бактерии, МПК. Медицинские лаборатории Мэйо. Доступно в Интернете по адресу https: // www.mayomedicallaboratories.com/test-catalog/Clinical+and+Interpretive/56031. По состоянию на апрель 2018 г.

    (© 2018). Анитмикробная чувствительность — гены mecA / mecC с помощью ПЦР. Лаборатории Аруп. Доступно в Интернете по адресу http://ltd.aruplab.com/Tests/Pub/0060211. По состоянию на апрель 2018 г.

    Rifai, N. et al. (© 2018). Учебник Тиц по клинической химии и молекулярной диагностике, шестое издание. Устойчивость к противомикробным препаратам и рекомендации по тестированию основных бактериальных патогенов, стр. 173700014 — 173700024.Доступно в Интернете по адресу https://expertconsult.inkling.com/read/rifai-tietz-textbook-clinical-chemistry-molecular-diagnost-6e/chapter-75/antimicrobial-resistance-and. По состоянию на апрель 2018 г.

    (обновлено 2 апреля 2018 г.). О лабораторных испытаниях и ресурсах AR. Центры по контролю и профилактике заболеваний. Доступно в Интернете по адресу https://www.cdc.gov/drugresistance/laboratories.html. По состоянию на апрель 2018 г.

    (3 апреля 2018 г.). Сдерживая необычное сопротивление. Центры по контролю и профилактике заболеваний.Доступно в Интернете по адресу https://www.cdc.gov/vitalsigns/contain-unusual-resistance/index.html. По состоянию на апрель 2018 г.

    Устойчивость к противомикробным препаратам. Ассоциация лабораторий общественного здравоохранения. Доступно в Интернете по адресу https://www.aphl.org/programs/infectious_disease/Pages/Antimicrobial-Resistance.aspx. По состоянию на апрель 2018 г.

    Источники, использованные в предыдущих обзорах

    Томас, Клейтон Л., редактор (1997). Циклопедический медицинский словарь Табера. Компания F.A. Davis, Филадельфия, Пенсильвания [18-е издание].

    Пагана, Кэтлин Д. и Пагана, Тимоти Дж. (2001). Справочник Мосби по диагностическим и лабораторным тестам, 5-е издание: Mosby, Inc., Сент-Луис, Миссури.

    (апрель 2004 г.). Проблема устойчивости к антибиотикам. Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.niaid.nih.gov/factsheets/antimicro.htm.

    (4 апреля 2003 г.). Устойчивость к антибиотикам, растущая угроза. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США [он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http: // www.fda.gov/oc/opacom/hottopics/anti_resist.html.

    (19 февраля 2004 г.). Разумное использование антибиотиков. Mayoclinic.com, Центр инфекционных заболеваний [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.mayoclinic.com/invoke.cfm?id=FL00075.

    (ноябрь 2003 г.). Информационный бюллетень о туберкулезе с множественной лекарственной устойчивостью. Американская ассоциация легких [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.lungusa.org/site/pp.asp?c=dvLUK9O0E&b=35815.

    Брен, Л. (сентябрь 2003 г., исправленная). Битва ошибок: борьба с устойчивостью к антибиотикам.Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, журнал FDA Consumer [Электронная информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.fda.gov/fdac/features/2002/402_bugs.html.

    Генри «Клиническая диагностика и лечение с помощью лабораторных методов». 21-е изд. Макферсон Р.А. и Пинкус М.Р., ред. Филадельфия: 2007, стр. 1048-1057.

    (14 марта 2009 г.) Медицинская энциклопедия MedlinePlus. Анализ чувствительности. Доступно в Интернете по адресу http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003741.htm. По состоянию на май 2009 г.

    Форбс, Б.et. al. (© 2007). Диагностическая микробиология Бейли и Скотта, двенадцатое издание: Mosby Elsevier Press, Сент-Луис, Миссури. С. 187-214.

    (6 августа 2007 г.). Станьте умнее: знайте, когда антибиотики работают, часто задаваемые вопросы. CDC [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.cdc.gov/getsmart/index.html. По состоянию на июнь 2009 г.

    Sutphen, S (30 августа 2007 г.). Устойчивость к антибиотикам в отделении неотложной помощи: первая линия защиты. Medscape CME [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http: // www.medscape.com/viewarticle/562056. Дата обращения 24.08.08.

    Барклай, Л. (3 июля 2008 г.). Использование антибактериальных средств Medscape в домашних условиях может повысить устойчивость к микробам. Medscape Medical News [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.medscape.com/viewarticle/577055. По состоянию на июнь 2009 г.

    Nicasio, A. et. al. (13 мая 2008 г.). Текущее состояние грамотрицательных бацилл с множественной лекарственной устойчивостью в Северной Америке. Medscape from Фармакотерапия [Он-лайн информация].Доступно в Интернете по адресу http://www.medscape.com/viewarticle/572674. По состоянию на июнь 2009 г.

    (27 августа 2009 г.). Лечение туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью и широкой лекарственной устойчивостью: текущее состояние и перспективы на будущее. Медицинская информация Medscape Reuters [Электронная информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.medscape.com/viewarticle/706826. По состоянию на июнь 2009 г.

    (© 1995-2013). Чувствительность к противомикробным препаратам, аэробные бактерии, МПК. Клиника Мэйо Медицинские лаборатории Мэйо [Он-лайн информация].Доступно в Интернете по адресу http://www.mayomedicallaboratories.com/test-catalog/Overview/8073. По состоянию на август 2013 г.

    Vorvick, L. (Обновлено 22 января 2013 г.). Анализ чувствительности. Медицинская энциклопедия MedlinePlus [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003741.htm. По состоянию на август 2013 г.

    Hazen, K. (отредактировано в феврале 2013 г.). Тестирование на восприимчивость. Пособие Merck для специалистов здравоохранения [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http: // www.merckmanuals.com. По состоянию на август 2013 г.

    Street, T. и Schmidt, S. (Обновлено 18 октября 2012 г.) Чувствительность к противомикробным препаратам. Справочник по Medscape [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://emedicine.medscape.com/article/2103786-overview. По состоянию на август 2013 г.

    Макферсон Р. и Пинкус М. (© 2011). Клиническая диагностика и лечение Генри с помощью лабораторных методов, 22-е издание: Elsevier Saunders, Филадельфия, Пенсильвания. Стр. 11117-1128.

    Дисковая диффузия — обзор

    Методы испытаний на чувствительность

    Дисковая диффузия по методу Кирби-Бауэра — это стандартизированный метод тестирования быстрорастущих патогенов. 89 Вкратце, стандартизованный посевной материал (т.е. допускается прямая суспензия колоний для получения стандартизованного посевного материала) наносят мазками на поверхность агара MH (т.е. диаметром чашки 150 мм). Поскольку воспроизводимость зависит от фазы логарифмического роста организмов, используются свежие субкультуры. Диски из фильтровальной бумаги, пропитанные стандартной концентрацией антимикробного агента, помещаются на поверхность, и размер зоны ингибирования вокруг диска измеряется после инкубации в течение ночи.Конкретные диапазоны времени инкубации указаны в документах Института клинических и лабораторных стандартов [CLSI].

    Анализ микроразбавления бульона обычно используется для количественного определения МИК. 90 Подносы MIC могут быть изготовлены на заказ в лаборатории или приобретены на коммерческой основе. Обычно от пяти до восьми концентраций антибиотиков, представляющих терапевтически достижимые диапазоны, тестируют против каждого организма, или от одной до трех концентраций используют для определения активности при контрольной точке МИК.Последний позволяет только качественную оценку восприимчивости; точный MIC неизвестен. Интерпретация этих несколько произвольных стандартов должна производиться в контексте организма, вероятного места заражения, плотности организма в этом месте и иммунокомпетентности хозяина.

    Автоматизированные инструменты могут предоставить результаты от 2 до 18 часов. 91 В США обычно используются четыре автоматизированные системы: bioMérieux VITEK Legacy или VITEK 2, Beckman Coulter MicroScan WalkAway, BD Phoenix и Trek Diagnostic Systems Sensititre.VITEK 2 обеспечивает чувствительность и идентификацию уже через 2 часа после инокуляции. Пластиковые карты с реактивами содержат небольшие лунки или микрокюветы, которые позволяют одновременно тестировать множество различных противомикробных агентов. Рост обнаруживается с помощью денситометра. Он использует определенные турбидиметрическим методом кинетические измерения роста для вычисления значений MIC с помощью регрессионного анализа.

    MicroScan использует субстраты, которые выделяют флуорофоры после взаимодействия с бактериальными ферментами, что приводит к усилению флуоресценции.Основным недостатком является то, что некоторые бактерии не выделяют флуорофоры после роста. 92 Чтобы решить эту проблему, MicroScan встроил в панели быстрые турбидиметрические считыватели. В зависимости от организма результаты доступны от 4,5 до 18 часов инкубации.

    BD Phoenix может одновременно обслуживать до 100 панелей. Индикатор добавляется в бульон каждого изолята, и индикатор окислительно-восстановительного потенциала измеряет рост бактерий. Надежные результаты могут быть получены примерно через 10 часов инкубации. 93

    Sensititre можно настроить с помощью полностью автоматизированного, полуавтоматического или ручного оборудования. Система Sensititre ARIS 2X рассчитана на 64 планшета и может выполнять комбинацию из 192 тестов MIC, контрольных точек или идентификационных тестов на одном приборе.

    Преимущества автоматизированных систем заключаются в том, что они могут быть подключены к лабораторной информационной системе, предоставлять быстрые результаты испытаний, допускать внутрилабораторную и межлабораторную стандартизацию, они менее трудозатратны и обладают потенциалом искусственного интеллекта для анализа данных. 91 Недостатки тоже заслуживают внимания. Системы могут быть слишком ограничительными для некоторых лабораторий. Панели и карточки форматируются производителем с использованием заранее определенных антимикробных агентов и концентраций, которые могут быть недостаточно различимы для многих клинических ситуаций. Панно и карты на заказ стоят дорого. Системы подходят не для всех организмов; неприемлемые результаты (обычно результаты теста на ложную чувствительность) могут быть получены для таких бактерий, как P. aeruginosa, S. pneumoniae, энтерококков, Stenotrophomonas maltophilia, и коагулазонегативные стафилококки. 92 Первоначальные капитальные вложения могут быть непомерно высокими для некоторых объектов, и на случай отказа системы всегда требуется резервная система. 94,95 Данные, поступающие через компьютерный интерфейс, должны быть проверены на точность. Контроль качества зависит от использования организмов из Американской коллекции культур тканей.

    E-test (bioMérieux) — это метод, который объединяет дисковую диффузию и разведение в агаре для определения МИК и обеспечивает точные воспроизводимые количественные результаты.E-test предлагает простой метод тестирования анаэробов и привередливых бактерий. 96–99 Вкратце, непроницаемая инертная полоска несет заметный непрерывный градиент концентрации предварительно определенного антибиотика, состоящего из более чем 15 двукратных разведений. После инкубации на засеянном агаре МИК считывают на краю зоны ингибирования, когда она пересекает полосу. Согласованность между дисковой диффузией, разведением агара и микроразведением бульона приближается к 95%. 100 E-test особенно полезен для проверки восприимчивости S.pneumoniae в пенициллин. По сравнению с микроразбавлением, Е-тест правильно классифицировал все устойчивые и среднеустойчивые штаммы. 101 Наилучшие результаты достигаются при инкубации агара в CO 2 . 102–104

    Определение чувствительности к антибиотикам в условиях отсутствия культур на основе спектров комбинационного рассеяния одной бактерии

    Дизайн исследования

    Стандартный тест на микроразбавление в бульоне, используемый для определения МИК антибиотика, основан на серии ночных бактериальных культур в присутствии антибиотик в возрастающих концентрациях.Используемый диапазон концентраций соответствует серии удвоенных концентраций, включая низкие и высокие контрольные точки, как они определены CLSI и EUCAST (таблица 1 и методы), и зависит от вида бактерий. Мониторинг роста в каждой культуре позволяет определить МИК, при которой бактерии не растут. МИК под нижней контрольной точкой определяет восприимчивые штаммы, тогда как значения МИК выше высокой контрольной точки определяют резистентные штаммы.

    Таблица 1 Описание биологической модели и экспериментальной базы данных.Были протестированы три антибиотика: гентамицин, подавляющий синтез белка, ципрофлоксацин, предотвращающий сверхспирализацию ДНК, и амоксициллин, препятствующий синтезу клеточной стенки. Для каждого из них перечислены клинические контрольные точки из EUCAST 4 для E . coli , проверенные концентрации, эталоны чувствительных и устойчивых штаммов E . coli с соответствующими МИК (измеренными в Vitek®2). Каждый «эксперимент» заключался в тестировании в один день одного штамма в присутствии одного антибиотика в нескольких концентрациях (включая 0) и получении около 50 спектров на концентрацию; его тиражировали в разные даты.Общая база данных содержит 3668 спектров отдельных бактерий. Обратите внимание, что E . Штамм coli ATCC 25922 является эталоном для контроля качества AST, рекомендованным EUCAST.

    Здесь, на основе того же принципа, мы инкубировали серию бактериальных суспензий в присутствии антибиотиков при возрастающих концентрациях в диапазоне от ниже низкой точки разрыва до выше высокой точки разрыва, определенной EUCAST (см. Таблицу 1). Культуры бактерий без антибиотика также инкубировали в качестве эталона.Время инкубации в присутствии антибиотиков было сокращено до двух часов перед проведением рамановского хемометрического анализа отдельных клеток. Для этого из суспензии отбирали бактерии и помещали на покровное стекло для получения спектров комбинационного рассеяния на отдельных бактериальных клетках. После получения спектров каждый спектр был предварительно обработан для удаления фонового сигнала (в основном флуоресценции) и сигнала стекла (см. Подробности в разделе «Методы»), чтобы уменьшить влияние небиологического и неспецифического сигнала 25 .Результирующие спектры, нормированные на их среднюю интенсивность в интересующей области [650–1750] см –1 , были названы «нормализованными суммарными спектрами». Для ясности в нижеследующем описании бактерии, которые инкубировали в течение 2 часов с антибиотиком, называются «незащищенными» бактериями и бактериями, которые инкубируются без антибиотика, «незащищенными» бактериями. Тест проводился как на чувствительном штамме, так и на устойчивом штамме для каждой молекулы антибиотика (см. Таблицу 1), чтобы подтвердить специфичность обнаруженного эффекта.Метод применялся для трех бактерицидных антибиотиков с разными механизмами действия: аминогликозида, хинолона и бета, -лактама. Полученные экспериментальные условия суммированы в таблице 1. Для каждого протестированного антибиотика были проведены анализы жизнеспособности, которые заключались в культивировании образцов на агаризованной культуральной среде непосредственно после инкубации с антибиотиком. Это позволило нам подтвердить, что в наших условиях антибиотики действовали на бактериальные клетки и приводили к потере жизнеспособности, как и следовало ожидать для различных концентраций антибиотиков (см. Дополнительный рис.1). У устойчивых штаммов потери жизнеспособности не наблюдалось. Мы подтвердили, что количество клеток было не меньше, чем до инкубации образца, путем подсчета клеток с помощью микроскопии (данные не показаны). Эта нумерация в сочетании с более классической нумерацией чашек Петри подтвердила, что мы могли наблюдать и собирать спектры бактерий, которые все еще находились в образце, но больше не могли расти. Таким образом, мы убедились, что в нашем исследовании не было систематической ошибки путем выбора конкретной популяции клеток из-за протокола подготовки образца и что мы измеряли воздействие на клетки, на которые воздействовал антибиотик.

    Извлечение спектральной сигнатуры эффекта антибиотика

    Чтобы извлечь рамановскую сигнатуру действия антибиотика на отдельные бактерии, мы сначала проанализировали изменения, индуцированные в спектрах комбинационного рассеяния отдельных бактериальных клеток, когда они подвергались воздействию ингибирующих концентраций антибиотиков. Такие модификации проиллюстрированы рис. 1 в случае чувствительного элемента E . coli клеток (EC1; см. Таблицу 1) инкубировали в течение 2 часов в отсутствие или в присутствии гентамицина при восьмикратном превышении соответствующей МИК (8 мкг / мл).Хотя спектральные различия между экспонированными и необлученными бактериями были очень слабыми (см. Необработанные спектры на рис. 1a, b и нормализованные сетевые спектры на рис. 1c, d), они могли четко прослеживаться на небольшом количестве пиков комбинационного рассеяния (см. Увеличение на рис. 1в, г). Они сопровождались гораздо более высокой межклеточной спектральной вариабельностью в присутствии антибиотика, сосредоточенной на нескольких специфических пиках комбинационного рассеяния (рис. 1e). Анализ главных компонентов (PCA) нормализованных сетевых спектров (рис. 1f) ясно показал эту повышенную вариабельность среди спектров подвергшихся воздействию бактерий, а также частичное различение спектров необработанных бактерий.Это свидетельствует о том, что действие антибиотика не было однородным среди отдельных клеток в бактериальной популяции, хотя потеря жизнеспособности в этих условиях составила более 99,99% (см. Дополнительный рис. 1). Очень похожие спектральные модификации можно было наблюдать на одном и том же штамме в присутствии ингибирующих концентраций ципрофлоксацина и амоксициллина (не показано).

    Рисунок 1

    Рамановские спектры отдельных бактериальных клеток из чувствительных клеток E . coli штамм EC1 инкубировали в течение 2 часов в отсутствие или в присутствии 8 мкг / мл гентамицина.Необработанные спектры в отсутствие ( a ) (44 спектра) и ( b ) в присутствии (39 спектров) антибиотика, полученные в одном эксперименте; ( c , d ) соответствующие нормализованные сетчатые спектры в интересующей области [650–1750] см −1 с увеличением области [1400–1520] см −1 и ( e ) связанные дисперсионные спектры бактерий, инкубированных с (синий) и без (красный) антибиотиком; ( f ) График PCA нормализованных чистых спектров, свидетельствующий об увеличенной дисперсии среди подвергнутых воздействию бактерий (синие точки) и их различении от незащищенных бактерий (красные точки).Соответствующие эллипсы 50% уверенности нанесены в качестве наглядного пособия.

    Чтобы выделить спектральные изменения, которые были специфичны для эффекта антибиотика и произошли с небольшой амплитудой, мы вычислили «разностные спектры», определяемые как разность между каждым нормализованным чистым спектром и средним значением всех нормализованных чистых спектров, измеренных на необлученные бактериальные клетки в том же эксперименте (т. е. того же штамма и даты). Эта процедура была разработана для удаления основной части специфичной для штамма информации и метаболической изменчивости, исходящей от бактерий в разные даты, и свидетельствует о спектральных изменениях, которые воспроизводимы для разных дат и штаммов.

    Таким образом, мы смогли четко определить действие антибиотика на чувствительный штамм. Результаты, представленные на фиг. 2 для трех антибиотиков, показали, что разностные спектры экспонированных восприимчивых бактериальных клеток демонстрируют значимые и воспроизводимые положительные и отрицательные пики. Это проиллюстрировано средним значением этих разностных спектров, обозначенным синей линией на рис. 2a – c и сопровождаемым вышеупомянутой высокой межклеточной изменчивостью, сконцентрированной в одних и тех же положениях пиков (диапазон ± σ вокруг среднего значения, показанного светом -синяя полоса на рис.2а – в). Пики были более очевидными для гентамицина (рис. 2a) и ципрофлоксацина (рис. 2b), чем для амоксициллина (рис. 2c), где они были значительно уменьшены при усреднении. Напротив, не наблюдалось значительных спектральных модификаций для подверженных воздействию устойчивых бактерий (среднее значение их разностных спектров показано красной линией на рис. 2a – c), для которых межклеточная изменчивость также оказалась ниже (розовый цвет). группа). Это подтверждает специфичность спектральных изменений, вызванных антибиотиком на чувствительном штамме.Для трех антибиотиков графики PCA тех же разностных спектров (рис. 2d – f) показали более очевидные спектральные изменения, в том числе для амоксициллина, которые значительно отделяли экспонированные (синие точки) от необлученных (голубые точки) восприимчивые бактериальные клетки, причем последние накладываются точно на экспонированные (красные точки) и необлученные (розовые точки) резистентные бактерии. Графики PCA также показали, что результаты для подверженных воздействию чувствительных бактерий были вполне воспроизводимыми с настоящего момента (наложены темно-синие эллипсы для трех дат экспериментов на рис.2г – е).

    Рис. 2

    Спектральная характеристика эффекта антибиотика, извлеченная из разностных спектров отдельных бактериальных клеток. «Разностные спектры» ( i , и . Различия между каждым нормализованным чистым спектром и средним значением всех нормализованных чистых спектров, измеренных на необлученных бактериальных клетках) отдельных бактериальных клеток, инкубированных в течение 2 часов, показаны для ( a ) гентамицин (0 и 8 мкг / мл, 374 спектра), ( b ) ципрофлоксацин (0 и 0.064 мкг / мл, 483 спектра) и ( c ) амоксициллина (0 и 8 мкг / мл, 474 спектра). Для наглядности показано только среднее значение разностных спектров для уязвимых бактерий (синяя линия) и устойчивых (красная линия), а также соответствующий диапазон стандартного отклонения ± σ (голубые и розовые полосы). . ( d – f ) Соответствующие графики PCA разностных спектров для восприимчивых бактерий, экспонированных (синие точки) и не экспонированных (голубые точки), а также для устойчивых бактерий, подвергшихся воздействию и не подвергшихся воздействию (соответственно.красные и розовые точки). Эллипсы 50% уверенности также нанесены одними и теми же цветами независимо для каждой из трех дат экспериментов в качестве наглядного руководства для демонстрации воспроизводимости экспериментов. ( г – i ) Графики векторов нагрузки, LV1 для ( г ) гентамицина и ( ч ) ципрофлоксацина, дающие веса, участвующие в оценке PC1, и LV ‘= (LV1 – LV2) × √2 / 2 для ( i ) амоксициллина, давая веса, участвующие в оценке (PC1 – PC2) × √2 / 2. Эти векторы нагрузки составляют «спектральную сигнатуру» эффекта антибиотика.

    На графиках PCA основное разделение спектров от подверженных воздействию чувствительных бактерий и спектров от незащищенных или устойчивых бактерий наблюдалось параллельно оси первого «главного компонента» (PC1) для гентамицина и ципрофлоксацина (рис. 2d). , д). Для амоксициллина (рис. 2f) и для этого конкретного ограниченного набора данных он был скорее параллелен направлению PC1 – PC2. (Для более крупных наборов данных амоксициллина, включающих больше концентраций, как показано на рис. 3 или рис. 4, ось PC1 была более точно выровнена с наблюдаемыми сдвигами.) Поэтому мы исследовали «вектор нагрузки» LV1 (рис. 2g, h для гентамицина и ципрофлоксацина) или LV ‘= (LV1 – LV2) × √2 / 2 (рис. 2i для амоксициллина), который дает спектральные характеристики которые вносят вклад в оценку PC1 или, соответственно, в оценку (PC1 – PC2) × √2 / 2, с их весами (положительными или отрицательными). Положительная оценка соответствует увеличению пиков с положительной массой в векторе загрузки и уменьшению пиков с отрицательной массой по сравнению со спектрами необлученных бактериальных клеток (и наоборот, отрицательной оценке).Таким образом, этот вектор составлял подходящую «спектральную сигнатуру» эффекта антибиотика. Поразительно, что сигнатуры, полученные для трех антибиотиков, были очень похожими (рис. 2g – i). Также заметно, что для гентамицина (рис. 2d) и амоксициллина (рис. 2f) эффект антибиотика отражался как в спектрах с положительным сдвигом, так и в спектрах с отрицательным сдвигом в PC1 (соответственно PC1 – PC2). Этого не произошло с ципрофлоксацином (рис. 2e), для которого наблюдались только положительные сдвиги. Это будет более подробно рассмотрено в следующих разделах.Спектральные зоны, вносящие значительный вклад в сигнатуру, соответствуют спектральным характеристикам, типичным для спектров комбинационного рассеяния бактерий: пики с положительными весами при 783 см 1 , 1240 см -1 , 1483 см -1 и 1574 см -1 , приписываются нуклеиновой кислоте 15 , тогда как пики при 1125 см -1 и 1443 см -1 с отрицательными весами обычно приписываются белкам 15 .

    Рис. 3

    Анализ зависимости эффекта от дозы для трех антибиотиков.( a – c ) графики PCA разностных спектров (ранее определенных в тексте и на рис. 2) для отдельных бактериальных клеток чувствительного штамма (EC1), инкубированных в течение 2 часов с ( a ) гентамицином (382 спектра), ( b ) ципрофлоксацин (345 спектров) и ( c ) амоксициллин (418 спектров) в различных концентрациях (от двух до четырех независимых экспериментов на концентрацию и антибиотик в большинстве случаев), с эллипсами 50% уверенности, нанесенными для каждой концентрации. ( d f ) Ящичковые диаграммы распределений оценок PC1 для различных концентраций антибиотика (с указанием соответствия между цветами и концентрациями).Вертикальные черные линии показывают контрольные МПК.

    Рисунок 4

    Анализ гетерогенности спектральных модификаций чувствительного бактериального штамма EC1, подвергнутого воздействию различных антибиотиков. ( a ) Общий PCA разностных спектров (2481 спектр) отдельных бактериальных клеток из чувствительного штамма EC1 для трех антибиотиков во всех концентрациях. Точки, соответствующие экспонированным (или необлученным) клеткам, показаны серым (соответственно красным), что свидетельствует о различении действия антибиотика параллельно оси PC1.( b ) Соответствующий вектор нагрузки LV1 рассматривается как общая спектральная характеристика эффекта антибиотика. ( c e ) Отдельные гистограммы оценок PC1 спектров различия для каждого антибиотика. Гистограммы четко показывают два [для ципрофлоксацина ( d )] или три [для гентамицина ( c ) и амоксициллина ( e )] пика распределения. Соответствующие популяции разграничиваются путем подгонки гистограмм с (2 или 3) распределениями Гаусса и помещением пороговых значений баллов в значения, которые выравнивают области хвоста перекрывающихся распределений [вертикальные пунктирные линии в ( c e )].Цветовой код, используемый для подгонки по Гауссу, является общим для ( c k ) и объясняется ниже. Таким образом, каждый спектр различий был отнесен к одной из трех групп в соответствии с его баллом PC1. Полученные спектры средней разности трех групп показаны в ( f h ). Группа разностных спектров с низкими оценками около 0 содержит разностные спектры всех необлученных бактерий и называется группой «без эффекта» (синее распределение). Группа спектров с высокими положительными баллами (называемая «эффект ATB +», оранжевое распределение) и группа спектров с высокими отрицательными баллами (называемая «эффектом ATB -», зеленое распределение) специфичны для подверженных воздействию чувствительных бактерий.( i k ) Графики относительных размеров 3 групп в зависимости от концентрации антибиотика для каждого антибиотика. Для ципрофлоксацина ( d , g , j ) группа «эффект АТБ -» не наблюдается. Вертикальные черные линии в ( i k ) показывают контрольные значения MIC.

    Анализ зависимости доза-эффект

    Чтобы определить, можно ли напрямую использовать эту спектральную характеристику эффекта антибиотика и соответствующий балл для определения МИК чувствительного штамма, мы изучили вариации (и распределения) Оценка PC1 отдельных бактериальных клеток EC1, инкубированных с возрастающими концентрациями антибиотика, от значительно меньших (включая 0) до значительно превышающих МИК.Результаты, полученные для трех антибиотиков (см. Рис. 3), показали, что оценка PC1 имеет тенденцию к увеличению с увеличением концентрации антибиотика, по крайней мере, для гентамицина и ципрофлоксацина (рис. 3d, e). Однако это изменение было в значительной степени замаскировано высокой спектральной изменчивостью от клетки к клетке (рис. 3a – c), которую мы наблюдали, особенно при высоких концентрациях антибиотиков. В случае амоксициллина даже может наблюдаться снижение показателя PC1 с увеличением концентрации (рис. 3f, от 0 до 2 мкг / мл и от 4 до 8 мкг / мл).Обратите внимание, что на этих новых графиках PCA вектор нагрузки LV1, связанный с PC1 (не показан), был очень похож на спектральную сигнатуру, показанную на рис. 2g – i.

    Для дальнейшего анализа распределения оценок PC1 для различных концентраций антибиотика, принимая во внимание тот факт, что были обнаружены очень похожие спектральные сигнатуры для эффекта антибиотика с тремя антибиотиками, мы рассчитали глобальный PCA для всех разностных спектров. измеряли на отдельных бактериальных клетках чувствительного штамма (все три антибиотика, все концентрации, все эксперименты).Основная дискриминирующая ось для эффекта антибиотика снова была обнаружена параллельно PC1, практически без дискриминации вдоль оси PC2 (см. Фиг. 4a). Вектор нагрузки LV1, связанный с главным компонентом PC1, затем был взят в качестве общей спектральной характеристики эффекта антибиотика (рис. 4b), и мы построили глобальное распределение баллов PC1 для каждого антибиотика (рис. 4c – e). Полученные гистограммы ясно показали бимодальное (для ципрофлоксацина) или тримодальное (для гентамицина и амоксициллина) перераспределение спектров, что свидетельствует о существовании различных популяций бактериальных состояний.Эти популяции были ограничены путем подгонки гистограмм с (двумя или тремя) пиками Гаусса. Первую популяцию с низкими оценками (около нуля), соответствующими спектрам плоских разностей (спектр средней разности показан синим на рис. 4f – h), назвали группой «без эффекта». Вторая популяция с высокими положительными оценками была названа группой «эффект ATB +». Его средний разностный спектр (показан оранжевым на рис. 4f – h) характеризуется положительными пиками при 783 см, –1 , 1240 см, –1 , 1483 см, –1, и 1574 см, –1 и отрицательными. пики при 1125 см −1 и 1443 см −1 .Третья популяция с высокими отрицательными оценками была названа группой «эффект ATB -». Эта последняя группа имеет спектр средней разницы с примерно одинаковыми пиками и противоположными интенсивностями (зеленый на рис. 4f, h; не наблюдается для ципрофлоксацина). Чтобы дополнительно охарактеризовать взаимосвязь между концентрацией антибиотика и спектральным эффектом, мы рассчитали относительное содержание каждой из этих трех групп среди разностных спектров как функцию концентрации антибиотика. Полученные графики (рис. 4i – k) показали, что группа «без эффекта», как и ожидалось, содержала все незащищенные бактерии.При увеличении концентрации антибиотика относительный размер этой группы постепенно уменьшался. Напротив, группы «эффект ATB +» и «эффект ATB–» наблюдались только среди подвергшихся воздействию бактерий (за исключением ципрофлоксацина, для которого группа «эффект ATB–» не наблюдалась) и постепенно увеличивались в размере с увеличением концентрации антибиотика. Это важное наблюдение показывает, что на уровне отдельных бактериальных клеток модификация спектральных свойств комбинационного рассеяния (следовательно, метаболического состояния) не изменяется непрерывно.Вместо этого бактериальные клетки демонстрируют или не показывают сигнатуру антибиотического эффекта в своем спектре, и только доля бактериальных клеток с измененным спектром изменяется с концентрацией антибиотика. Эта популяционная модель является ключевым элементом для полного улавливания и понимания эффекта антибиотиков с помощью измерений спектров комбинационного рассеяния.

    Обратите внимание, что сосуществование этих двух или трех групп при данной концентрации антибиотика, возможно, с сопоставимыми относительными размерами, в значительной степени объясняет высокую дисперсию, наблюдаемую среди спектров подверженных воздействию чувствительных бактерий, описанных выше.Это также объясняет, почему эта дисперсия в основном сосредоточена на 6 положениях пиков, перечисленных выше. Кроме того, мы заметили, что для каждого антибиотика группа «без эффекта» снизилась ниже 50%, в то время как две другие группы стали большинством при концентрациях, близких к МИК (см. Значения МИК в Таблице 1), что позволяет предположить, что наблюдение одиночных клеток Рамановские спектры можно использовать для оценки MIC данного штамма. Как описано в следующих параграфах, мы подтвердили эту возможность, разработав прямой метод определения МИК на основе машинного обучения и используя только несколько спектров отдельных бактерий для каждой концентрации.

    Автоматическое определение эффекта антибиотика и определение МИК

    Основой нашего подхода было использование контролируемого машинного обучения для автоматического распознавания эффекта антибиотика в нескольких спектрах отдельных бактериальных клеток и повторения этого теста для серии бактериальных суспензий тот же штамм инкубировали с увеличивающимися концентрациями антибиотика, чтобы определить, произошел ли переход и при какой концентрации по сравнению с контрольной МИК. Первым шагом для каждого антибиотика было создание обучающей базы данных разностных спектров, принадлежащих к двум классам: класс «без эффекта» с разностными спектрами от необлученных чувствительных бактериальных клеток и класс «эффект ATB» только с разностные спектры чувствительных бактериальных клеток, подвергшихся действию ингибирующих концентраций антибиотика (≥2 мкг / мл для гентамицина, ≥0.005 мкг / мл для ципрофлоксацина и ≥8 мкг / мл для амоксициллина). Все спектры устойчивых штаммов были исключены из этой обучающей базы данных.

    Для классификации использовался алгоритм SVM с ядром «радиальной базисной функции» (RBF) 26 (программное обеспечение доступно на http://www.csie.ntu.edu.tw/~cjlin/libsvm) для работы с нелинейный характер наблюдаемого эффекта, особенно сосуществование противоположных популяций «ATB-эффект +» и «ATB-эффект-» среди разностных спектров подверженных воздействию чувствительных бактерий.Обратите внимание, что, хотя мы использовали полные разностные спектры для классификации, мы заметили, что линейный SVM имеет ограниченную производительность для этой задачи. Это говорит о том, что полные данные не были или плохо линейно разделялись из-за вышеупомянутых противоположных популяций, что подтверждается в двух измерениях PCA (рис. 4a), следовательно, использование ядра RBF. Чтобы обеспечить надежную и строгую проверку классификатора, избегая любого артефакта переобучения или искажающего эффекта, мы следовали схеме перекрестной проверки «оставить одну-дату-нет».Для этого мы построили валидационное разбиение, сгруппировав все разностные спектры, соответствующие заданной дате, в одной и той же тестовой группе. Эта группа была исключена из обучающего справочника при тестировании. Конечно, это было реализовано путем конструирования в случае устойчивых штаммов или более низких концентраций, поскольку они не были включены в обучающую базу данных. С помощью этой схемы проверки спектры каждого эксперимента тестировались только с использованием спектров из других экспериментов в качестве эталона.

    Из-за высокой межклеточной спектральной изменчивости, включая присутствие подвергшихся воздействию бактерий без наблюдаемых спектральных изменений, необходимо было повторить тест на небольшом количестве разностных спектров, чтобы надежно решить, были ли бактериальные клетки восприимчивы к антибиотику или нет. заданная концентрация. В целях проверки достоверности теста в реальных условиях, как можно более близких к клиническому применению прямого образца, мы ограничили средний спектр незащищенных бактерий, используемый при вычислении разностных спектров, до того же небольшого числа не подвергавшихся воздействию бактерий.Мы смогли достичь удовлетворительных результатов только с 5 разностными спектрами для гентамицина и ципрофлоксацина (от 5 экспонированных и 5 необлученных клеток) и 11 разностных спектров для амоксициллина (от 11 экспонированных и 11 необлученных клеток). Классификатор пометил каждый из 5 (или 11) тестируемых спектров различий, и большинство голосов было применено для присвоения класса тестируемому набору. Подробные характеристики представлены в виде матриц неточностей на рис. 5 (см. Также дополнительный рис. 2–4 для матриц неточностей, полученных с другими числами разностных спектров).Для восприимчивого штамма (рис. 5a – c) наблюдался резкий переход для концентраций, близких к МИК, от маркировки «Нет эффекта» под МИК к маркировке «эффект ATB» над МИК. Для устойчивых штаммов (рис. 5d – f) классификатор не обнаружил антибиотического эффекта, независимо от используемого антибиотика или используемой концентрации, за исключением штамма EC2 с гентамицином в очень высоких концентрациях, близких или превышающих МИК. Это подтверждает как высокую специфичность теста, так и то, что он не зависит от штамма.Обратите внимание, что, за исключением концентрации непосредственно ниже MIC, где произошел переход, правильная скорость мечения (как «Нет эффекта» или «Эффект ATB» в зависимости от концентрации и деформации) всегда была выше 97% (со средним значением 99,3% в 24 испытанных условиях, исключая концентрацию ниже МПК). Эти результаты показывают, что предлагаемый метод не только способен надежно определять чувствительный / резистентный фенотип бактериального штамма при каждой тестируемой концентрации, но также оценивать его MIC для каждого из протестированных антибиотиков.

    Рис. 5

    Матрицы неточностей для автоматического различения классов «Нет эффекта» и «Эффект ATB» при различных концентрациях антибиотиков с помощью классификатора SVM.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

    © Copyright 2019 Все права защищены

    Публикации не следует рассматривать как врачебные рекомендации.

    Предупреждаем: прежде чем воспользоваться рецептом, посоветуйтесь с врачом.