Календула химический состав: Календула. Применение, описание, химический состав, противопоказания и лечебные свойства календулы

Таблица 1– Относительные уровни соединений от C.лекарственный , обладающий антиоксидантным потенциалом .

Таблица 2 — Спектрофотометрически определенные каротиноиды цветка C. officinalis в различных растворителях .

Благодарности

Этот документ был опубликован в рамках проекта « Школа постдокторантуры по сельскому хозяйству и ветеринарной медицине », POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371, софинансируемого Европейским социальным фондом через Отраслевую оперативную программу для человека. Развитие ресурсов 2007-2013 гг.

Ссылки

• Basch E, Bent S, Foppa I, Haskmi S, Kroll D, Mele M, Szapary P, Ulbricht C, Vora M, Yong S. Marigold ( Calendula officinalis L.): подтверждено доказательствами систематический обзор Natural Standard Research Collaboration. J Herb Pharmacother. 2006; 6: 135–59. DOI: 10.1080 / J157v06n03_08. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Календула лекарственная -L. (HTML) Plants For A Future (PFAF) http://www.pfaf.org/user/Plant.aspx?LatinName=Calendula+officinalis Дата обращения 2011/11/04.
• Интерактивная флора Северо-Западной Европы. Календула лекарственная. Проверено 12 августа 2011.
• Национальные институты здравоохранения. «Календула» (HTML). Травы и пищевые добавки. Национальная медицинская библиотека США; Проверено 19 октября 2011. [Google Scholar]
• Muley BP, Khadabadi SS, Banarase NB. Фитохимические компоненты и фармакологическая активность Календула лекарственная Linn (Asteraceae) Trop J Pharm Res. 2009. 8: 455–465. [Google Scholar]
• Танака Т., Мацуо И., Куно И.Обзор: химия вторичных полифенолов, образующихся при переработке чая и отдельных пищевых продуктов. Int J Mol Sci. 2010; 11: 14–4. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Chakraborthy GS. Фитохимический скрининг экстракта листьев Calendula Officinalis Linn методом ТСХ. Int J Res Ayurveda Pharma. 2010; 1: 131–134. [Google Scholar]
• Neukiron H, D’Ambrosio M, Dovia J, Guerriero A. Одновременное количественное определение восьми тритерпеноидных моноэфиров в цветках 10 разновидностей Calendula officinalis L.и характеристика нового моноэфира тритерпеноида. Фитохим Анал. 2004; 15: 30–35. DOI: 10.1002 / pca.739. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Джулиано Дж., Тавацца Р., Директто Дж., Бейер П., Тейлор М.А. Метаболическая инженерия биосинтеза каротиноидов в растениях. Trends Biotechnol. 2008. 26: 139–145. DOI: 10.1016 / j.tibtech.2007.12.003. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Кишимото С., Маока Т., Сумитомо К., Омия А. Анализ каротиноидного состава лепестков календулы ( Calendula officinalis L.) Biosci Biotechnol Biochem. 2005; 69: 2122–8. DOI: 10.1271 / bbb.69.2122. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Preethi KC, Kuttan R. Ранозаживляющая активность цветочного экстракта Calendula officinalis . J Basic Clin Physiol Pharmacol. 2009; 20: 73–9. [PubMed] [Google Scholar]
• Preethi KC, Kuttan G, Kuttan R. Антиоксидантный потенциал Календула лекарственная Цветки in vitro и in vivo . Pharmaceutical Biol. 2006. 44: 691–697. DOI: 10.1080/13880200601009149. [CrossRef] [Google Scholar]
• Guinot P, Gargadennec A, Valette G, Fruchier A, Andary C. Первичные флавоноиды в красителе календулы: экстракция, структура и участие в процессе окрашивания. Фитохим Анал. 2008; 19: 46–51. DOI: 10.1002 / pca.1014. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Braga PC, Dal Sasso M, Culici M, Spallino A, Falchi M, Bertelli A, Morelli R, Lo Scalzo R. Антиоксидантная активность экстракта Calendula officinalis : ингибирующие эффекты на хемилюминесценция вспышек нейтрофилов человека и спектроскопия электронного парамагнитного резонанса.Фармакология. 2009; 83: 348–55. DOI: 10,1159 / 000217583. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Мецзомо Н., Мартинес Дж., Феррейра С.С. Экономическая жизнеспособность SFE из персика, миндаля, мяты и календулы. J Food Eng. 2011; 103: 473–479. DOI: 10.1016 / j.jfoodeng.2010.10.032. [CrossRef] [Google Scholar]
• Хэдфилд Р.А., Влахович Т.К., Хан Т. Использование календулы для лечения кожных заболеваний в подиатрической области. Голеностопный сустав стопы J. 2008; 1: 1–8. DOI: 10.1186 / 1757-1146-1-1. [CrossRef] [Google Scholar]
• Мулей Б.П., Хадабади С.С., Банарас Н.Б.Фитохимические компоненты и фармакологическая активность Календула лекарственная Linn (Asteraceae) Tropical J Pharm Res. 2009. 8: 455–465. [Google Scholar]
• Сильва Э. Дж. Р., Гонсалвес Э. С., Агиар Ф., Эвенсио Л. Б., Лира ММА, Коэльо MCOC, Фрага MCCA, Wanderley AG. Токсикологические исследования водно-спиртового экстракта Календулы лекарственной L. Фитотерапевтические исследования. 2007. 21: 332–336. DOI: 10.1002 / ptr.2009. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Naguib NY, Khalil MY, El Sherbeny SE.Сравнительное исследование продуктивности и химических составляющих различных источников и видов растений календулы , подвергшихся воздействию двух листовых удобрений. J Appl Sci Res. 2005; 1: 176–189. [Google Scholar]
• Халид К.А., Тейшейра да Силва Дж.А. Урожайность, содержание эфирного масла и пигмента в цветочных головках Calendula officinalis L., культивируемых в условиях солевого стресса. Sci Hort. 2010; 126: 297–305. DOI: 10.1016 / j.scienta.2010.07.023. [CrossRef] [Google Scholar]
• Паолини Дж., Барбони Т., Дежобер Дж. М., Джабу Н., Музелли А., Коста Дж.Химический состав, внутривидовые и сезонные колебания эфирных масел Calendula arvensis L. Biochem Syst Ecol. 2010. 38: 865–874. DOI: 10.1016 / j.bse.2010.07.009. [CrossRef] [Google Scholar]
• Fronza M, Heinzmann B, Hamburger M, Laufer S, Merfort I. Определение раневого эффекта экстрактов календулы с использованием анализа царапин с фибробластами 3T3. J Ethnopharmacol. 2009; 126: 463–467. DOI: 10.1016 / j.jep.2009.09.014. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Безбрадица Д., Милич-Ашкрабич Дж., Петрович С.Д., Шилер-Маринкович С.Исследование влияния растворителя на кинетику разложения каротиноидов в масляных экстрактах C. officinalis . J Serb Chem Soc. 2005. 70: 115–124. DOI: 10.2298 / JSC0501115B. [CrossRef] [Google Scholar]
• Лу С., Ли Л. Метаболизм каротиноидов: биосинтез, регуляция и не только. J Integrative Plant Biol. 2008. 50: 778–785. DOI: 10.1111 / j.1744-7909.2008.00708.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Fonseca YM, Catini CD, Vicentini FTMC, Nomizo A, Gerlach RF, Fonseca MJV.Защитный эффект экстракта Calendula officinalis против окислительного стресса, вызванного ультрафиолетом B, в коже: оценка снижения уровня глутатиона и секреции матриксной металлопротеиназы. J Ethnopharmacol. 2010; 127: 596–601. DOI: 10.1016 / j.jep.2009.12.019. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Ириани Р., Мальдонаде Д., Родригес-Амайя Б., Адилма Р., Скампарини П. Каротиноиды дрожжей, выделенные из экосистемы Бразилии. Food Chem. 2008; 107: 145–150. DOI: 10.1016 / j.foodchem.2007.07.075.[CrossRef] [Google Scholar]
• Раал А., Кирсипуу К. Общее содержание флавоноидов в сортах Calendula officinalis L., происходящих из разных стран и возделываемых в Эстонии. Nat Prod Res. 2011; 25: 658–62. DOI: 10.1080 / 14786419.2010.528417. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Прити К., Чандран Р.К. Влияние экстракта цветков Calendula officinalis на белки острой фазы, механизм антиоксидантной защиты и образование гранулем во время термических ожогов.J Clin Biochem Nutr. 2008; 43: 58–64. DOI: 10.3164 / jcbn.2008043. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Фариа Р.Л., Кардосо Л.М., Акисуэ Дж., Перейра, Калифорния, Джункейра Дж. С., Хорхе А.О., Сантос Жуниор П.В. Противомикробная активность Calendula officinalis, Camellia sinensis и хлоргексидина в отношении прикрепления микроорганизмов к швам после удаления непрорезавшихся третьих моляров. J Appl Oral Sci. 2011; 19: 476–82. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Butnariu M, Palicica RD.Buletinul Oficial de Proprietate Industriala, Патентные заявки. Vol. 3. ОСИМ, РО122836-Б1; 2010. Аптечная мазь на основе цветков календулы, выращенных на обогащенных цинком почвах, и способ ее приготовления; С. 1–18. [Google Scholar]
• Preethi KC, Siveen KS, Kuttan R, Kuttan G. Ингибирование метастазирования клеток меланомы B16F-10 у мышей C57BL / 6 с помощью экстракта цветков Calendula officinalis L. Азиатский Pac J Cancer Prev. 2010; 11: 1773–9. [PubMed] [Google Scholar]
• Ло Дж., Чжан Л., Ван М., Хе С., Ян Ю.Определение кверцетина и кемпферола в растениях Dysosma методом RP-HPLC. Чжунго Чжун Яо За Чжи. 2010; 35: 3021–3023. [PubMed] [Google Scholar]
• Даниэльски Л., Кампос LMAS, Брешиани Л.Ф.В., Хенсе Х., Юнес Р.А., Феррейра С.С. Олеорезин календулы ( Calendula officinalis L.): растворимость в SC-CO ₂ и профиль состава. Chem Eng Proc. 2007. 46: 99–106. DOI: 10.1016 / j.cep.2006.05.004. [CrossRef] [Google Scholar]
• Раал А., Кирсипуу К., Муст Р., Тенно С. Содержание общих каротиноидов в Calendula officinalis L.из разных стран, выращиваемых в Эстонии. Nat Prod Commun. 2009; 4: 35–8. [PubMed] [Google Scholar]
• Газим З., Резенде С., Фрага С., Диас Филхо Б., Накамура С., Кортез Д. Анализ эфирных масел из Календулы лекарственной , растущей в Бразилии, с использованием трех различных процедур экстракции. Brazil J Pharm Sci. 2008; 44: 391–395. [Google Scholar]
• Сильва Э. Дж., Коста-Сильва Дж. Х., Эвенсио Л. Б., Фрага Мдо С., Коэльо М. С., Wanderley AG. Репродуктивная оценка водно-спиртового экстракта календулы лекарственной календулы лекарственной L.у крыс линии Вистар. Phytother Res. 2009; 23: 1392–8. DOI: 10.1002 / ptr.2785. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Лич MJ. C. officinalis и заживление ран: систематический обзор. Раны. 2008. 20: 236–243. [PubMed] [Google Scholar]
• Око О.О., Садименко А.А., Афолаян А.Дж. Влияние возраста на урожайность и состав эфирных масел Calendula officinalis . J Appl Sci. 2007. 7: 3806–3810. [Google Scholar]
• Лю Цзинь, Ян Х, Ван К., Куанг Т., Чжан Дж., Гуй Л., Ань Х, Чанг В.Кристаллическая структура основного светособирающего комплекса шпината при разрешении 2,72 Å. Природа. 2004. 428: 287–292. DOI: 10,1038 / природа02373. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Гуськов А., Керн Дж., Габдулхаков А., Брозер М., Зуни А., Сенгер В. Фотосистема II цианобактерий с разрешением 2,9 Å и роль хинонов, липидов, каналов и хлорида. Nat Struct Mol Biol. 2009. 16: 334–342. DOI: 10.1038 / nsmb.1559. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Баллоттария М., Жирардона Дж., Далл’Остоа Л., Басси Р.Эволюция и функциональные свойства светособирающих комплексов Photosystem II у эукариот. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 2012; 1817: 143–157. DOI: 10.1016 / j.bbabio.2011.06.005. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Европейская фармакопея. PHARMEUROPA. 2011; 23 http: //www.edqm. eu / en / News-and-General-Information-43.html Дата обращения 2015/10/15. [Google Scholar]
• Granger KL, Gallagher RS, Fuerst EP, Alldredge JR. Сравнение методов фенольной экстракции семян и методов анализа. Методы Ecol Evol.2011; 2: 691–698. DOI: 10.1111 / j.2041-210X.2011.00120.x. [CrossRef] [Google Scholar]
• Тутин Т.Г., Хейвуд В.Х., Берджес Н.А., Валентайн Д.Х., Уолтерс С.М., Уэбб Д.А., редактор. Набор в мягкой обложке. Vol. 5. 2010. Флора европейская; п. 135. [Google Scholar]
• Ph. Eur. Справочные стандарты. http://www.edqm.eu/en/Ph-Eur-Reference-Standards-627.html Источник 2011/10/16.
• ВОЗ. Международные химические эталонные вещества. (ICRS) 2010. http://www.edqm.eu/en/WHO-International-Chemical-Reference-Substances-ICRS-1393.html Проверено 18 октября 2011 г.
• ISO-14502-1: 2005; и AOAC 941.15.AOAC, 2003

Оценка биологически активных соединений цветков календулы лекарственной с использованием спектрофотометрии

Chem Cent J. 2012; 6: 35.

Моника Бутнариу

¹ Кафедра химии и биохимии, Банатский университет сельскохозяйственных наук и ветеринарной медицины, Тимишоара, Калеа Арадулуи, no.119, Тимишоара, 300645 Румыния

Кристина Жепа Корадини

² Кафедра фитотехники, Банатский университет Банатский университет сельскохозяйственных наук и ветеринарной медицины, Тимишоара, Калеа Арадулуи, no. 119, Тимишоара, 300645 Румыния

¹ Кафедра химии и биохимии, Банатский университет сельскохозяйственных наук и ветеринарной медицины, Тимишоара, Калеа Арадулуи, no. 119, Тимишоара, 300645 Румыния

² Кафедра фитотехники, Банатский университет Банатский университет сельскохозяйственных наук и ветеринарной медицины, Тимишоара, Калеа Арадулуи, no.119, Тимишоара, 300645 Румыния

^# Распространяется поровну.

Поступило 01.04.2012 г .; Принято 27 апреля 2012 г.

Дополнительные материалы

Дополнительный файл 1 Таблица 1– Относительные уровни соединений из экстрактов C. officinalis , обладающих антиоксидантным потенциалом .

GUID: D746C5B3-F4DF-48BF-8FF5-562FD1FE1F75

Дополнительный файл 2 Таблица 2 — Спектрофотометрически определенные каротиноиды C.лекарственный цветок в разных растворителях .

GUID: 60E199FB-91E7-4511-A51D-E1289B3E9C18

Аннотация

Предпосылки

Это исследование было направлено на количественное определение активных биологических соединений в цветках C. officinalis . Основываясь на действующих веществах и биологических свойствах цветков бархатцев, описанных в литературе, мы стремились получить и охарактеризовать молекулярный состав экстрактов, приготовленных с использованием различных растворителей.Антиоксидантную способность экстрактов оценивали с помощью спектрофотометрии для измерения как оптической плотности колориметрического акцептора свободных радикалов 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (DPPH), так и общего антиоксидантного потенциала с использованием анализа восстанавливающей способности железа (FRAP).

Результаты

Спектрофотометрические анализы в ультрафиолетовой и видимой (UV-VIS) области позволили идентифицировать и охарактеризовать весь спектр фенольных и флавоноидных кислот, а высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) использовалась для идентификации и количественного определения фенольных соединений ( в зависимости от метода добычи).Метанол обеспечивает более эффективное извлечение флавоноидов, чем другие испытанные растворители.

Антиоксидантная активность метанольных экстрактов коррелировала с содержанием полифенолов.

Выводы

УФ-видимые спектры пигментов-ассимиляторов (например, хлорофиллов), полифенолов и флавоноидов, экстрагированных из цветков C. officinalis , заключались в количественной оценке соединений, поглощающих волны с длиной волны более 360 нм.

Общие сведения

Благодаря особому составу и экономической ценности выращивание бархатцев ( C.officinalis ) продолжает расти [1], а Европейский Союз спонсировал несколько программ по изучению и эксплуатации этого вида [2-4]. Лечебные свойства бархатцев объясняются разнообразием содержащихся в них биологически активных веществ [5]. Благодаря своим противовоспалительным, заживляющим и антисептическим свойствам экстракты C. officinalis применяются наружно для лечения различных кожных язв, экземы и конъюнктивита, а также внутрь для облегчения боли, возникающей при язве желудка и воспалении.Бархатцы известны своими спазмолитическими, расслабляющими, желчегонными, потогонными и ранимыми свойствами [6]. Как фенольные соединения (флавоноиды и фенольные кислоты), так и сапонины содержатся в большом количестве в ноготках [7].

C. officinalis также содержит каротиноиды и тритерпеновые спирты как в свободном, так и в этерифицированном виде [8,9]. Каротиноидные пигменты, производные C. officinalis [10] и полиненасыщенные жирные кислоты, такие как календовая кислота [5], обладают воспалительными свойствами in vivo и ингибирующими свойствами in vitro [11].

Бархатцы также характеризуются присутствием некоторых важных поликарбогидратов [12], которые растворимы в воде и играют роль в спаивании тканей и контроле клеточной проницаемости [13-15]. Другими веществами, идентифицированными в экстрактах C. officinalis , являются белки и аминокислоты [16], насыщенные углеводороды [17], витамин C [18] и минеральные вещества [19]. Благодаря своему сильному аромату [20] эфирные масла могут привлекать насекомых, тем самым косвенно способствуя опылению [21-23].

Некоторые летучие вещества [24] представляют собой конечные продукты анаэробного биоразложения углеводов [25] и накапливаются до уровней, сопоставимых с уровнями, синтезируемыми в клетках [26].

Помимо их роли в качестве антиоксидантов [27], полифенолы (особенно флавоноиды) обладают антимикробными свойствами [28,29].

В наших предыдущих исследованиях использовалась хроматография, чтобы продемонстрировать, что бархатцы являются хорошим источником природных антиоксидантов, в частности полифенольных веществ.

Полифенолы обычно характеризуются своим специфическим хроматографическим поведением и характерными спектрами UV-VIS.

Целью данного исследования было использование спектрофотометрии для оценки содержания фенольных и флавоноидных соединений, а также активности по улавливанию радикалов в экстрактах из различных образцов календулы. Основные фенольные соединения C. officinalis , протестированные в этом исследовании, были систематически идентифицированы путем сравнения профилей ВЭЖХ образцов с профилями подлинных фенольных стандартов и опубликованными данными (информация в патентах RO122836 — B1) [30]. Мы использовали ВЭЖХ для одновременного разделения, обнаружения и количественного определения фенольных соединений, хлорофиллов и каротиноидов за один проход.Наличие метода получения биоактивного профиля различных матриц растительности должно помочь удовлетворить растущие потребности в информации о биологических соединениях и их свойствах не только о цветках календулы, но и о других естественных источниках пищи.

Результаты

Спектрофотометрические анализы

Настоящее исследование описывает метод Folin-Ciocalteu (FC) для быстрого анализа и количественной оценки. Быстрый метод был проверен с точки зрения повторяемости, воспроизводимости, линейности, точности, затем был проведен оптимизированный аналитический метод для количественного определения фенольных соединений.Спектрофотометрические анализы для определения общего содержания флавоноидов и полифенолов в растительных экстрактах были адаптированы для использования со спектрофотометром UV-VIS (PG Instruments) и soft UV WIN 5.05 для измерения оптической плотности контрольных растворов (QE и GA) и оптической плотности образцов. из экстрактов растений [31]. Спектрофотометрические анализы для расчета концентраций кверцетина (QE) основывались на измерениях оптической плотности при 420 нм. Спектрофотометрическое определение содержания галловой кислоты (GA) рассчитывали при 765 нм.Линейность метода проверяли методом наименьших квадратов, который применялся в диапазоне концентраций 2-32 мкг / мл для QE и 1-10 мкг / мл для GA, с коэффициентом корреляции R ² > 0,99. Для проверки результатов повторяющиеся калибровочные кривые сравнивали с эталонными веществами в течение трех дней подряд. Наблюдалась небольшая разница между калибровочными кривыми, построенными для QE, тогда как кривые для GA были почти идентичны. Все коэффициенты детерминации уравнений калибровочных прямых (R ² ) были больше 0.99. Точность метода рассчитывалась путем сравнения определенного количества вещества с количеством вещества, рассчитанным на основе статистического анализа с помощью программы ORIGIN 7 (версии Standard / Professional). Для всех контрольных образцов различия между экспериментальными образцами и стандартами никогда не были статистически значимыми ( P <0,05). Точность (процентное отклонение определенной концентрации по отношению к рассчитанной концентрации) и прецизионность (стандартное отклонение / коэффициент вариации) методов всегда находились в пределах допустимых диапазонов (± 15% от среднего).

Чувствительность метода рассчитывалась с использованием 2 мкг / мл QE и 1 мкг / мл GA. В обоих случаях, когда точность и прецизионность, указанные в допустимых пределах в таких определениях, складывались в предел количественного определения (± 20%).

Фитохимические вещества и, в частности, соединения фенольных кислот и флавоноидов, присутствующие в цветках C. officinalis , могут частично отвечать за эти преимущества для здоровья благодаря своей антиоксидантной активности. В настоящем исследовании основные цели заключаются в выделении общего количества флавоноидов и полифенольных соединений с помощью спектрофотометрических анализов в ультрафиолетовом и видимом диапазоне.Чтобы быстро различать различные образцы, флавоноиды экстрагировали из цветов путем погружения (без разрушения ткани) в растворители (метод ВЭЖХ, мы исследуем патент RO122836-B1).

Высокоэффективная жидкостная хроматография

В соответствии с международными стандартами Ассоциации по улучшению органических культур (OCIA), Международной федерации движений за органическое сельское хозяйство (IFOAM) и Национальной программы органического сельского хозяйства США, использование экологически чистых материалов Для получения таких натуральных ингредиентов необходимы дружественные процедуры экстракции, такие как мацерация.

Мы использовали объективный анализ ВЭЖХ в сочетании со спектрофотометрическими методами для исчерпывающей характеристики полифенолов, включая соединения с антиоксидантным потенциалом, такие как флаванолы, фенольные кислоты и каротиноиды, из экстракта цветков C. officinalis . Наиболее распространенные фенольные соединения были количественно определены с помощью ВЭЖХ по сравнению с внешними стандартами известных фенольных соединений.

Общее содержание полифенолов, флавоноидов и оценка антиоксидантной активности с использованием DPPH и FRAP

Концентрации полифенолов в экспериментальных образцах варьировались в зависимости от типа растительного материала и растворителя, используемого для экстракции.Значения, определенные с использованием метода DPPH (дополнительный файл 1 и рисунок), показали, что антиоксидантная активность была значительно выше у сорта P ₂ , чем у сорта P ₁ . Это можно объяснить большей ферментативной активностью в первом. Измерения проводились в диапазоне длин волн от 440 до 750 нм. Все сканы, полученные с использованием экспериментальных образцов, сравнивали со сканированными изображениями, полученными с использованием чистых растворителей. Измерения проводили через 30 минут после добавления DPPH, чтобы обеспечить достаточно времени для реакции антиоксидантов с DPPH.Как показано в Дополнительном файле 1, изменения оптической плотности на этой длине волны показывают, находятся ли радикалы DPPH в окисленном или восстановленном состоянии. Таким образом, эта длина волны обеспечивает прямой анализ и интерпретацию измеренного уменьшения поглощения. Гидрофильную антиоксидантную активность оценивали с использованием методов FRAP и DPPH. Антиоксидантная активность была выше в образцах из сорта P ₂ , чем в образцах из сорта P ₁ , возможно, из-за более высоких уровней биосинтеза в первом случае, чем во втором.Использование методов FRAP привело к одинаково малым значениям для всех трех типов экстрактов. Огромное распространение материалов и биологических жидкостей, содержащих биологически активную молекулу, не способствовало принятию общего метода, доступного для экстракции, который можно было бы применять в общих чертах и ​​принимать как стандартизированную технику. Широкий спектр используемых аналитов и растворителей не позволил нам использовать стандартную процедуру экстракции на протяжении всего исследования. Экстракция каротиноидов с использованием униполярных органических растворителей [32], этилового эфира или хлороформа включала мацерацию растительной ткани с последующим механическим встряхиванием и переносом экстрактов в кипящую водяную баню.Для полной экстракции требовалось значительное растирание; потому что униполярный растворитель не проникает через клеточную мембрану для растворения каротиноидов.

Содержание соединений с антиоксидантным потенциалом из экстрактов C. officinalis .

Поскольку свежий материал имеет высокие уровни, его необходимо сначала высушить перед экстракцией смешивающимися растворителями, такими как ацетон, метанол и этанол [33,34]. Тогда растительный материал может быть достаточно безводным, чтобы можно было проводить экстракцию с использованием неводных растворителей.

Целью этой экспериментальной части было количественное определение антиоксидантной активности с помощью спектрофотометрии (дополнительный файл 1). Мы разработали простой и эффективный метод извлечения. Он должен был идентифицировать флавоноиды в его экстрактах, определить количество и сделать прогноз его антиоксидантной способности спектрофотометрическим методом DPPH. Модель улавливания стабильного радикала DPPH является широко используемым методом для оценки способности различных образцов улавливать свободные радикалы.

Анализ пигментов

Органические экстракты содержали каротиноиды, а также некоторые отходы, такие как хлорофилл [35,36]. Анализ результатов Дополнительного файла 2 показывает различия в содержании пигментов-ассимиляторов в проанализированных образцах. Более высокие количества хлорофилла b (рисунок и рисунок) предполагают способность тканей цветка улавливать световое излучение, чтобы повысить способность растений преобразовывать световую энергию в потенциальную химическую энергию.Образцы, которые производят большее количество углеводов, получают из тканей, которые обеспечивают вещества, необходимые для развития [37].

Спектр поглощения 80% метанольных экстрактов цветов C. officinalis .

Спектры поглощения цветков C. officinalis в метаноле 80%, этаноле 96%, изопропаноле 99% и этаноле 60% .

Как сообщалось ранее [38], квантосома (комплекс между фотосинтетическими пигментами и белково-фосфорными мембранами граны) [39] включает 230 молекул хлорофилла (Chl) (160 молекул Chl a и 70 молекул Chl b ) и приблизительно 50 молекул каротиноидов.Молекулы хлорофилла a действуют как реакционные (улавливающие) центры (P ₇₀₀ в фотосистеме (PS) I и P ₆₈₀ в PS II). Теоретически соотношение Chl a : Chl b может варьироваться от 1: 2 до 1: 3. Из наших данных для сорта Petran (P ₁ ), единственного образца, для которого соотношение между типами хлорофилла a / b хлорофилла в соотношении 1: 2 — метанольный экстракт (образец 1). Соотношение в трех других экстрактах составляло 1: 3.Для экстрактов метанола и этанола сорта Plamen (P ₂ ) мы обнаружили соотношение Chl a : Chl b , равное 1: 4. Вариации относительного содержания хлорофиллов a и b могут быть связаны с нарушениями на уровне ФС II [40]. Сканирование длин волн всех экстрактов C. officinalis показано на рисунке. Специфические модели поглощения позволили нам идентифицировать определенные группы молекул и домены. Одна из наиболее важных функций каротиноидов — фотозащита фотосинтетического аппарата путем тушения триплетного хлорофилла, синглетного кислорода и других активных форм.

Каротиноиды являются структурными компонентами светособирающего хлорофилла a / b белковых комплексов PSII (LHCII) и PS I. Они участвуют как в стабилизации тримеров LHCII, так и в сборке мономеров LHCII [41]. Чтобы быть полезным в качестве меры клеточного антиоксидантного потенциала, поглощение на выбранной длине волны должно в основном зависеть от радикала DPPH, а не от помех, вызываемых антиоксидантами, такими как каротиноиды и полиненасыщенные жирные кислоты.Учитывая, что сигналы с длинами волн ниже 530 нм сильно зависят от каротиноидов, это может привести к неверной интерпретации измеренного уменьшения поглощения при выборе длины волны, на которую влияют как радикал DPPH, так и абсорбционные свойства экстракта, как это происходит для экстрактов, содержащих каротиноиды. В значительной степени этот вид помех может быть устранен путем измерения оптической плотности эталонного образца, содержащего тот же экстракт, что и образец, содержащий DPPH.

Наши усилия по количественному определению общего содержания каротиноидов в экстрактах показывают важность растворителя, выбранного для экстракции образцов.Метанол извлекает каротиноидные пигменты более эффективно, чем любой из других протестированных растворителей.

Обсуждение

Мы использовали два спектрофотометрических метода, которые включают захват свободных радикалов в растворе с помощью DPPH и оценку общего антиоксидантного потенциала (FRAP), чтобы предоставить дополнительные источники доказательств различных антиоксидантных потенциалов экстрактов из C. лекарственный цветков. Сопоставляя состав фенольных соединений с антиоксидантным действием в тканях цветов, мы обнаружили, что экстракты из C.officinalis сорт Пламен (P ₂ ) обладал более высоким антиоксидантным потенциалом, чем экстракты из сорта Petran (P ₁ ). Связь между антиоксидантной активностью и содержанием флавоноидов не была линейной, что позволяет предположить, что антиоксидантная активность зависит от общего содержания полифенолов. Летучие органические биосоединения напрямую поддаются анализу с помощью газовой хроматографии, метода непревзойденной разделительной способности.

Флавоноиды считаются предпочтительными биосоединениями в качестве хемотаксономических маркеров растений, поскольку они демонстрируют большое структурное разнообразие и химически стабильны.

В разработанной в данной работе методике идентификации и количественного определения основных фенольных соединений по образцам использовались более доступные методы FC для определения полифенолов.

Метод, основанный на классических нормах и стандартных рабочих процедурах, разработанных в отделе биохимии, дал каждому критерию валидации значение, соответствующее ограничениям ранее упомянутых норм.

Выводы

Антиоксидантные компоненты в экстрактах идентифицировали с помощью комбинированных методов ВЭЖХ и спектрофотометрического анализа.С помощью спектрофотометрического анализа экстрактов в УФ-видимом диапазоне мы идентифицировали определенные фенольные кислоты и флавоноиды.

Метанол позволяет более эффективно извлекать флавоноиды, чем другие исследованные растворители. Наибольшая антиоксидантная активность, связанная с содержанием полифенолов, была получена для экстрактов, приготовленных с использованием метанола. Биохимический анализ определил содержание пигментов-ассимиляторов, а также флавоноидов, которые были выражены как эквиваленты QE. После получения спектрофотометрической дозировки флавоноидов, выраженной в QE, значения включали следующие: 96.17 / 34,8 QEmg / 100 мл.

Согласно Европейской фармакопее минимальным условием качества было 0,4% общих флавоноидов, выраженных в QE. Качество сырья для бархатцев C. officinalis ( Flores Calendulae ) было обусловлено основным содержанием флавонов и полифенолов, которые накапливались в период цветения.

Методы

Образцы растений

Растения были собраны с поля на учебной базе USAMVB Timisoara.Два типа образцов растений, сорт Petran (P ₁ ) и Plamen (P ₂ ), были собраны и помечены на месте с использованием стандартных методов (сорта выращивались в одинаковых условиях).

Образцы растений, которые были сохранены в качестве гербарных образцов, были идентифицированы с использованием стандартного эталона для этой цели [42], по сравнению с образцами из Департамента растительных ресурсов и идентифицированы с помощью таксономистов из Департамента фитотехники растений в USAMVB Тимишоара.

Экстракция активных биологических соединений

Для экстракции использовались четыре растворителя: метанол (80%), этанол (96%), изопропанол (100%) и этанол (60%). Общий процесс мацерации в небольшом масштабе включал помещение измельченного соответствующим образом растительного материала или умеренно крупного порошка, изготовленного из него, в закрытую емкость и добавление выбранного растворителя, чтобы дать растворителю достаточно времени для проникновения через клеточную стенку для растворения компонентов внутри клетки и для того, чтобы полученный раствор проник через клеточную стенку наружу.Поскольку система статична, за исключением случайного встряхивания, процесс экстракции происходит за счет молекулярной диффузии, которая очень медленная. Закрытый сосуд используется для предотвращения испарения растворителя во время периода экстракции и, таким образом, позволяет избежать вариаций от партии к партии.

В конце процесса мацерации, когда будет достигнуто равновесие, раствор фильтруют, пропуская через специальный пресс.

Концентрации активных компонентов в процеженных и сцеженных жидкостях, иногда называемых мисцеллой, идентичны, поэтому их можно комбинировать.Учитывая, что отжатая жидкость может быть мутной с коллоидными и мелкими частицами, часто требуется определенное время для коагуляции и осаждения твердых частиц.

Осевший материал фильтруют с помощью фильтр-пресса или любого другого подходящего устройства.

Метод экстракции мацерацией — самый простой неизбирательный метод. C. officinalis. цветы выдерживали в холодной среде в контакте с растворителем при комнатной температуре (17-22 ° C) в течение 14 часов, периодически перемешивая перед отделением экстракта.Дополнительный раунд (ы) мацерации повысил эффективность процесса. Экстрагированный продукт сначала смешивали с 1 / 2-2 / 3 от общего количества растворителя, после чего жидкость отделяли и высвобождали остаток.

Он вступает в контакт с остальной частью растворителя, в результате чего добывается одна девятая часть раствора. Две жидкости экстрагируют и фильтруют вместе еще через 24 часа.

Из-за относительно пониженной термостойкости природных ароматических соединений процесс проводили в присутствии антиоксиданта аскорбиновой кислоты (0.5% мас. / Об.) [43]. Скорость экстракции (1:10 г порошка цветков / мл растворителя).

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

Полифенолсодержащие экстракты цветков C. officinalis разделяли на колонке C ₁₈ (150 мм × 4,6 мм, 3 мкм) с подвижной фазой, состоящей из трех различных растворителей, используя аппарат Agilent 1100 HPLC. Скорость потока составляла 0,7 мл / мин, а объем впрыска составлял 20 мкл. Для первой системы разделения (тройной растворитель), которая использовалась для разделения флаванолов и фенольных кислот, исходная подвижная фаза состояла из 2% уксусной кислоты в воде / метаноле.Для разделения флавонолов во второй системе (бинарный растворитель: 0,25 мМ фосфатный буфер, pH = 2,5 / ацетонитрил) полифенольные соединения разделяли с использованием третьей системы (бинарный растворитель: 0,1% муравьиная кислота в воде / метаноле). Температуру колонки устанавливали на 20 ° C.

Фенольные соединения обнаружены при 260 нм. Разделенные соединения идентифицировали путем сравнения их времени удерживания (Rt) и УФ-спектров со спектрами аутентичных стандартов. Соединения были определены количественно с использованием стандартной калибровочной кривой.

Общее содержание фенолов и флавоноидов было определено как сумма связанных идентифицированных фенольных соединений. Соединения были идентифицированы путем сравнения со стандартами каждого идентифицированного соединения с использованием Rt, профиля спектра поглощения, а также путем анализа образцов после добавления чистых стандартов [35].

Общее содержание полифенолов

Общее содержание полифенолов было рассчитано с использованием реагента FC и Na ₂ CO ₃ 10%; Впоследствии максимальное поглощение оценивали по полученной окраске относительно калибровочной кривой.Общее содержание фенольных соединений оценивали с помощью колориметрии, основанной на химическом восстановлении смеси оксидов вольфрама и молибдена с образованием синего продукта, который сильно поглощает при 760 нм.

Образование голубых соединений, полученных из FC-реактивных фенолов, не зависело от структур фенольных соединений, что позволило количественно оценить полный набор фенольных соединений из растительных экстрактов. Примерно 10 г измельченного растительного материала экстрагировали 100 мл растворителя.Общую концентрацию фенольных соединений в экстракте рассчитывали путем сравнения с кривой, построенной аналогичным образом на основе измерения, выполненного с использованием известных концентраций GA в диапазоне 0-00 мкг GA / 100 мл. Общее содержание фенолов в образцах выражали в эквивалентах GA (мг) на грамм высушенного растительного материала.

Уровни полифенолов выражали в мг / г эквивалента GA по отношению к конечной концентрации 20 мкг / мл.

Общее содержание флавоноидов

Суммарный уровень всех флавоноидов рассчитывали реакцией с 3% -ным (мас. / Об.) Раствором AlCl ₃ (безводная соль), приготовленным в этаноле.

Концентрации коррелировали со значениями абсорбции с помощью калибровочной кривой, построенной с использованием известных концентраций QE. Общее содержание флавоноидов, выраженное в мг / г (эквиваленты QE), было связано с конечной концентрацией на 20 мкг / мл.

Оценка антиоксидантной активности с использованием DPPH

Примерно 10 г измельченного растительного материала экстрагировали в 100 мл 80% -ного водного раствора этанола (или других растворителей) при комнатной температуре в течение 1 часа.

Экстракты фильтровали, и фильтры оставляли испаряться в сухой среде.

Процентную активность по улавливанию свободных радикалов определяли по формуле (1), где Ai было абсорбцией до добавления тестируемого экстракта, а Af было значением абсорбции после 5-минутного времени реакции: Ai

(1)

Эффект нейтрализации свободного радикала DPPH◦ был рассчитан при трех различных концентрациях метанольных и этанольных экстрактов: порции 0,05 мл экстрактов 10, 5 и 2,5 мг / мл смешивались с 2,95 мл раствора. DPPH◦ в кювете, используемой для спектрофотометрии.

По прошествии 5 минут реакции абсорбция при 420 нм сравнивалась с поглощением метанола. QE использовали в качестве положительного контроля. При концентрации 2,5 мМ QE был способен полностью нейтрализовать (уровень использованного радикала DPPH◦).

Анализ ферроредуцирующей антиоксидантной силы (FRAP)

Мы использовали простой спектрофотометрический метод для оценки антиоксидантной способности растительных экстрактов. Это включало восстановление трипиридилтриазина трехвалентного железа [Fe (III) -TPTZ] до окрашенного трипиридилтриазина двухвалентного железа [Fe (II) -TPTZ] при низком pH.

Цветной продукт сильно поглощает при длине волны 593 нм.

Анализ пигментов

Препараты C. officinalis применяются в основном в виде настоев, настоев и мазей как ранозаживляющее средство при воспалениях кожи, слизистых оболочек, плохо заживающих ран, синяках, фурункулах и высыпаниях, например, фарингитах и ​​т. язвы на ногах. [27] В реакции смешанных лимфоцитов 70% этанольный экстракт показал стимулирующее действие при 0.1-10 мкг / мл с последующим ингибированием при более высоких концентрациях. [60] Фагоцитоз человеческих гранулоцитов стимулировался полисахаридами, выделенными из водного экстракта цветков календулы [61]. Экстракты цветков календулы разной полярности проявляли антиоксидантное действие на перекисное окисление липосомных липидов, вызванное Fe ² + и аскорбиновой кислотой. [62,63] Изорамнетин 3-гликозиды из цветков календулы ингибировали липоксигеназу из цитозоля легких крысы при концентрация 1.5 × 10 ^-5 M. [64] В тестовой системе, основанной на щечных мембранах свиней, сильные зависящие от концентрации адгезивные процессы наблюдались с обогащенным полисахаридом экстрактом с низкой вязкостью (98% углеводов) цветков календулы . Эти данные свидетельствуют о том, что полисахариды могут способствовать терапевтическому эффекту при лечении раздраженной слизистой оболочки. [65] Обогащенная тритерпеном фракция, вводимая перорально мышам, инокулированным карциномой мыши Эрлиха, предотвращала развитие асцита и увеличивала время выживания по сравнению с контролем.[66] Тритерпены, такие как фарадиол и тараксастерол, ингибируют экспериментальное продвижение опухоли и поэтому считаются ингибиторами роста опухоли. [67] Фракция, богатая сапонином, вводимая перорально в дозе 50 мг / кг веса тела крысам с гиперлипемией, снижала уровень липидов в сыворотке. [68,69] Водно-спиртовой экстракт C. officinalis продемонстрировал ингибирующее действие на центральную нервную систему с заметной общей седативной активностью. как гипотензивный эффект. [70] Спиртовой экстракт цветков С.лекарственный обладает анти-ВИЧ свойствами. [71] Крем, содержащий экстракт календулы , эффективен при декстрановых и ожоговых отеках, а также при острой лимфедеме у крыс. Активность против лимфедемы в первую очередь приписывалась усилению протеолитической активности макрофагов. [72] Эфирное масло цветов подавляло рост in vitro Bacillus subtilis , Escherichia coli , S. aureus , Pseudomonas aeruginosa и Candida albicans .[73] Ацетон, этанол или водные экстракты подавляли рост in vitro гриба Neurospora crass. [74] Флавоноидная фракция, выделенная из цветков, подавляла рост in vitro S. aureus , Sarcina lutea , E. coli , Klebsiella pneumonia и Candida monosa . [75] 50% этанольный экстракт. растения показали спермицидную активность у крыс при концентрации 2%. [76]

C. suffruticosa подавляла патогенные микроорганизмы, особенно Pseudomonas syringae , Pseudomonas fluorescens , Xanthomonas campestris , Agrobacterium tumefaciens .[77]

Клинические исследования

В рандомизированном открытом контролируемом исследовании сравнивали эффекты трех мазей после местного лечения пациентов с ожогами 2 ^{или 3} степени в течение 17 дней: Мазь с цветком календулы (приготовленные перевариванием в вазелине) ( n = 53) или только вазелин ( n = 50) или протеолитическая мазь ( n = 53). Считалось, что частота успеха составляет 37/53 для мази с цветками календулы , , 27/50 для вазелина и 35/53 для протеолитической мази.[78] В открытом неконтролируемом пилотном исследовании 30 пациентов с ожогами или ожогами лечили 3 раза в день в течение до 14 дней гидрогелем, содержащим 10% гидроэтанольного экстракта. Симптомы покраснения, отека, пузырей, боли, болезненности и чувствительности к теплу оценивались до, во время и в конце лечения. Общий балл и индивидуальные баллы по каждому симптому улучшились. [79] У женщин с хирургическими ранами местное применение смеси, содержащей 70% масляный экстракт зверобоя Hypericum perforatum и 30% масляный экстракт C.arvensis улучшил скорость заживления по сравнению с контролем. [53] Было проведено рандомизированное единичное слепое исследование фазы III C. officinalis по сравнению с троламином для профилактики острого дерматита во время облучения по поводу рака груди. Пациенты, оперированные по поводу рака груди и получавшие послеоперационную лучевую терапию, были случайным образом распределены для применения либо мази Calendula , содержащей 20% свежих надземных частей календулы в вазелине (126 пациентов), либо троламина ( 128 пациентов) на облученных полях после каждого сеанса.Первичной конечной точкой было возникновение острого дерматита 2 степени или выше. Вторичными конечными точками были возникновение боли, количество использованного местного средства и удовлетворенность пациента. Частота возникновения острого дерматита 2 степени и выше была значительно ниже (41% против 63%; P <0,001) при использовании Calendula , чем при использовании троламина. Более того, пациенты, получавшие календулу , реже прерывали лучевую терапию и значительно снижали вызванную облучением боль.[80] Клиническое исследование мази с экстрактом C. officinalis было проведено у 34 пациентов с венозной язвой ног. В общей сложности 21 пациент с 33 венозными язвами лечился мазью, наносимой дважды в день в течение 3 недель. Контрольную группу, состоящую из 13 пациентов с 22 венозными язвами, лечили повязками с физиологическим раствором, наложенными на язвы в течение 3 недель. В опытной группе общая поверхность всех язв на момент начала терапии составила 67 544 мм ² .После 3 ^-й недели общая поверхность всех язв составила 39 373 мм ² (уменьшение на 41,71%). У семи пациентов была достигнута полная эпителизация. В контрольной группе общая поверхность всех язв на момент начала терапии составила 69 722 мм ² . После 3 ^-й недели общая поверхность всех язв составила 58 743 мм ² (уменьшение на 14,52%). У четырех пациентов была достигнута полная эпителизация. Отмечено статистически значимое ускорение заживления ран в опытной группе ( P, <0.05), что свидетельствует о положительном влиянии мази с экстрактом календулы на эпителизацию венозных язв [81].

Токсикология

Контакт с кожей препаратов Calendula , хотя и бывает редко, может вызвать аллергическую реакцию на это растение. Сообщалось о сенсибилизации к календуле и аллергических контактных реакциях. [82,83] Также были случаи анафилактического шока после полоскания горла настоем календулы . [84]

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Около 12-20 видов растений род Calendula был обнаружен в различных флорах.Среди них большинство этнофармакологических отчетов доступно по C. officinalis и C. arvensis . Кроме того, только четыре вида календулы были частично исследованы на предмет их фитосостава. Тщательное изучение литературы о календуле показывает, что три вида были исследованы фармакологически. Фармакологические исследования показывают, что C. officinalis проявляет антибактериальные, противовирусные, противовоспалительные, противоопухолевые и антиоксидантные свойства; С.arvensis обладает антибактериальным, противовоспалительным, антимутагенным и гемолитическим действием; и C. Suffruticosa проявляет антимикробную активность. C. officinalis включен в ряд лекарственных препаратов, которые используются в клинической практике для лечения различных заболеваний, например, заболеваний центральной нервной системы. Принимая во внимание этнофармакологические, фитохимические и фармакологические отчеты, низкую токсичность и частоту использования, C. officinalis , по-видимому, обладает большим потенциалом для углубленного изучения различных видов биологической активности.Немногочисленные предварительные фармакологические отчеты подтверждают лекарственный потенциал примерно видов календулы . Эти виды необходимо систематически исследовать с целью установления их разнообразной фармакологической активности и способов действия.

Химический состав и биологическая активность эфирных масел из цветков и листьев календулы лекарственной, журнал Flavor and Fragrance Journal

РЕФЕРАТ: Реферат Применение различных видов удобрений может влиять на биологическую активность Calendula officinalis .Настоящее исследование было направлено на изучение химических компонентов и антимикробных эффектов C. officinalis , выращенных в химических и биологических условиях на устойчивых к метициллину Staphylococcus aureus . Было собрано и культивировано четыреста образцов госпитальных инфекций. Штаммы MRSA подвергали дисковой диффузии и GC-Mass. Сто из 400 образцов госпитальных инфекций оказались положительными на MRSA (25%). Все изоляты также были положительными по гену mecA .В C. officinalis было обнаружено 40 различных химических компонентов. Наиболее изменчивые компоненты были обнаружены в контрольной группе (1,8-цинеол (30,456%), γ-терпинен (25,547%), терпинолен (4,584%), α-терпинеол (4,490%) и транс-β-оцинен (4,153%). %)). Применение биологических и химических удобрений привело к значительному увеличению уровней некоторых химических компонентов ( P <0,05). Штаммы MRSA обладают наивысшей устойчивостью к тетрациклину (95%), ампициллину (92%), пенициллину (90%). , гентамицин (88%) и ципрофлоксацин (77%).Контрольная группа имела самые высокие противомикробные эффекты, но эфирное масло C. officinalis , обогащенное обоими удобрениями, было эффективным в отношении устойчивого MRSA. Использование роста C. officinalis совместно с химическими и биологическими удобрениями было рекомендовано в качестве основного подхода к синтезу эффективных антибиотиков.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Календула лекарственная; Химические компоненты; Противомикробное действие; Устойчивый к метициллину Staphylococcus aureus; Биологическое удобрение; Химические удобрения

Введение

Золотистый стафилококк ( S.aureus ) — грамположительная кокковая бактерия и один из важнейших возбудителей различных типов госпитальных инфекций, включая системные инфекции (такие как инфекции мочевыводящих путей, дыхательных путей и крови, пневмония, синусит и пищевое отравление), а также кожные и инфекции мягких тканей (такие как раны, абсцесс, ожоги, фурункулез и импетиго) [1-3]. За последние 20 лет увеличилось количество как внебольничных, так и внутрибольничных инфекций, вызванных Staphylococcus aureus ( S. aureus ), и рост заболеваемости сопровождался увеличением числа устойчивых к антибиотикам штаммов, в частности метициллина. -устойчивый S aureus (MRSA) [4, 5].Штаммы MRSA имеют глобальное значение в связи с высокой распространенностью инфекций у пациентов, госпитализированных в больницы [4, 5]. Ген устойчивости к метициллину, mecA , находится на элементе размером от 21 до 67 т.п.н., который активно присутствует во всех инфекционных штаммах бактерий [6]. MRSA-штаммы клинических инфекций обладают высокой устойчивостью к широкому спектру антибиотиков, включая бета-лактамные антибиотики, в том числе пенициллины (метициллин, диклоксациллин, нафциллин, оксациллин и т. Д.)) и цефалоспорины и другие типы противомикробных агентов, включая эритромицин, котримоксазол, тетрациклин, пенициллин, гентамицин, цефексим и клиндамицин [7-10]. В связи с высокой распространенностью резистентности MRSA к широко используемым антибиотикам в больницах, необходимость применения и назначения новых противомикробных препаратов является существенной.

В последние годы большое внимание уделяется назначению лекарственных растений для лечения различных инфекционных заболеваний [11].Лекарственные растения — подходящие источники противомикробных агентов. Календула лекарственная ( C. officinalis ) — одно из наиболее часто используемых лекарственных растений среди иранцев, которое произрастает в регионах Средиземноморья [12]. C. officinalis , широко известный как календула, является однолетним травянистым растением и принадлежит к семейству сложноцветных. Цветки однодомны (отдельные цветки могут быть мужскими или женскими, но оба пола могут быть найдены на одном и том же растении) и опыляются пчелами.Он известен привлечением дикой природы. C. officinalis может широко применяться в качестве антисептического, противовоспалительного и рубцового, а также легкого антибактериального и противовирусного средства [11, 13-15]. Растение содержит эсквитерпеновые гликозиды, сапонины, ксантофиллы, триолтритерпены, флавоноиды, летучие вещества, δ-кадинен, α-кадинол, 1,3,5-кадинатриен и α-мууролол, которые обладают антиоксидантным и антимикробным действием [11, 13-16].

По высокой полезности посадки C.officinalis , фермеры перешли от использования различных видов сельскохозяйственных удобрений к повышению качества и количества, борьбе с вредителями и ускорению сбора урожая растений. Применение этих сельскохозяйственных удобрений и особенно биологических и химических (мочевина) удобрений может повлиять на химический состав, а также на терапевтическую активность эфирного масла, экстрагированного из C. officinalis . В некоторых случаях произошли значительные изменения в составе и эффективности лекарственных растений [17, 18].

В соответствии с высокой распространенностью штаммов MRSA в иранских случаях госпитальных инфекций, экономической, косметической и фармацевтической ценностью C. officinalis и отсутствием опубликованных данных о влиянии химических и биологических удобрений на компоненты и антимикробную активность C. officinalis , настоящее исследование было проведено для оценки химических компонентов и противомикробных эффектов различных препаратов C. officinalis на штаммы MRSA, выделенные от различных типов госпитальных инфекций в Иране.

Материалы и методы

Этические вопросы

Настоящее исследование было одобрено этическими комитетами Университета медицинских наук Бакияталлаха и больницы Хаджар, Иран. Письменное информированное согласие было получено от всех пациентов или их родителей. Письменное согласие было также подписано исследовательским отделом Исламского университета Азад в Шахрекорд (IAUSHK 110224) и этическими комитетами образовательных больниц, Тегеран, Иран.

Сбор проб и идентификация MRSA

С марта по октябрь 2015 года у госпитализированных пациентов иранских больниц было собрано в общей сложности 500 клинических образцов различных типов инфекций, которые были немедленно переведены в лабораторию в холодильнике со льдом.

Двадцать пять микролитров каждого образца высевали в бульон Мюллера-Хинтона (MHB, Merck, Германия) с добавлением 6,5% NaCl и гомогенизировали. Суспензию инкубировали 16–20 ч при 37 ° C.Один миллилитр обогащенной среды MHB добавляли к 9 мл бульона фенолового красного маннита, содержащего цефтизоксим (5 мкг / мл) и азтреонам (75 мкг / мл) (PHMB), и инкубировали в течение 16–20 часов при 37 ° C. Поверхность среды для селективного выделения MRSA ID инокулировали стерильной петлей. Чашки инкубировали в течение 24 часов при 37 ° C (когда колонии было трудно идентифицировать, инкубация затягивалась еще на 24 часа). Типичные зеленые колонии были известны как MRSA. Пять выбранных типичных колоний на чашку субкультивировали на триптон-соевом агаре (TSA, Merck, Германия).Типичные колонии тестировали с помощью теста Staphytect Plus (Oxoid), теста латексной агглютинации для обнаружения фактора слипания, белка А и некоторых полисахаридов, обнаруженных в MRSA.

ПЦР-подтверждение MRSA

Все штаммы MRSA культивировали на триптиказо-соевом бульоне (TSB) и инкубировали при 37 ° C в течение 18-24 часов. Геномную ДНК экстрагировали из бактериальных колоний с помощью набора для выделения и очистки ДНК (Cinagen, Иран) согласно инструкции производителя.Наличие штаммов MRSA подтверждено с помощью амплификации гена mecA на основе ПЦР [19]. Реакцию проводили в конечном объеме 50 мкл, содержащем 5 мкл 10 × буфера + MgCl ₂ , 2 мМ dNTP, 2 единицы ДНК-полимеразы Taq, 100 нг геномной ДНК в качестве матрицы и 25 пикомолей каждого праймера (5′- AAATCAGATGGTAAAGGTTGGC-3 ‘и 5′-AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC-3’) (533 п.н.). ПЦР выполняли с использованием термоциклера (Eppendorf Mastercycler 5330, Eppendorf-Nethel-Hinz GmbH, Гамбург, Германия) при следующих условиях: начальная денатурация в течение 1 минуты при 94 ° C и 40 циклов, включая 95 ° C в течение 30 с, 55 ° C в течение 30 с и 72 ° C в течение 1 минуты, и окончательное удлинение при 72 ° C в течение 5 минут. S. aureus ATCC 6538 использовали в качестве положительного контроля, а дистиллированную воду использовали в качестве отрицательного контроля. Пятнадцать микролитров продуктов ПЦР во всех реакциях разделяли на 1,5% агарозном геле, содержащем 0,5 мг / мл SYBR Green в буфере трис-борат-ЭДТА, при 90 В в течение 1 ч, также с использованием подходящих маркеров молекулярной массы. Продукты исследовали в ультрафиолетовом свете.

Лечение календулы лекарственной

На ферме производили различные обработки C. officinalis .После посадки растений в тех же условиях, восстание началось с различных обработок. Первая обработка C. officinalis была обработана химическим удобрением, содержащим мочевину. Вторая обработка проводилась с использованием биологических удобрений. Третья обработка была обработана как мочевиной, так и биологическими удобрениями. Контрольная группа росла в обычных условиях без каких-либо удобрений. Все остальные условия, включая процесс полива, освещение, тип почвы, температуру и влажность, были одинаковыми между обработками.После выращивания цветков C. officinalis были собраны и немедленно переданы в Центр медицинских и ароматических исследований Исламского университета Азад в Шахрекорд.

Экстракция эфирного масла

Пятьсот граммов свежих цветов каждой обработки подвергали гидродистилляции отдельно в течение 3 ч в цельностеклянном аппарате Клевенджера в соответствии с методом Британской фармакопеи [20].

ГХ-масс-анализ

Для изучения химического состава 4 различных обработок C.officinalis был использован метод ГХ-масс-анализа с использованием газового хроматографа Agilent 6890 Series II (Пало-Альто, США), соединенного с квадрупольным масс-спектрометром Agilent 5973 с режимом электронной ионизации (EI), генерируемым при 70 эВ (источник ионов при 230 ° C и линии передачи при 280 ° C). ГХ выполняли с использованием капиллярной колонки J&W DB-5 (5% дифенил- 95% диметилсиликон) (30 м x 0,25 мм внутренний диаметр x 0,25 мкм пленка), в качестве газа-носителя использовали гелий (1 мл / мин). Начальная температура была запрограммирована от 35 ° C до 60 ° C (при 1 ° C мин-1), до 170 ° C (3 ° C мин-1), до 200 ° C (8 ° C мин-1) и до 280 ° C (15 ° C мин-1) и выдерживают при 280 ° C в течение 5 мин.Порт инжектора (режим без деления потока, 0,5 мин) имел температуру 250 ° C. Индексы удерживания рассчитывались относительно наканов. Все соединения были идентифицированы путем сравнения масс-спектров (библиотека Wiley 275) и данных индекса удерживания, найденных в литературе [21].

Противомикробные эффекты различных средств лечения Календулы лекарственной

Дисковый диффузионный метод агара был использован для скрининга антибактериальной активности C. officinalisflowers [14]. Изоляты MRSA госпитальных инфекций человека переносили на среду Nutrient Agar (NA, Merck, Германия).Бумажные диски отдельно пропитывали 25 мкл эфирного масла с концентрацией 0,5 мг / мл и помещали на чашки с засеянным агаром. Все планшеты оставляли при комнатной температуре на 30 минут для диффузии эфирного масла, затем инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов. Чувствительность изолятов MRSA к эфирному маслу C. officinalisflowers также сравнивали с имеющимися в продаже антимикробными дисками. Чувствительность изолятов MRSA тестировали против ампициллина (10 мкг / диск), гентамицина (10 мкг / диск), пенициллина (10 мкг / диск), котримоксазола (30 мкг / диск), линкомицина (2 мкг / диск), ципрофлоксацина (5 мкг / диск), клиндамицин (2 мкг / диск), имипенем (30 мкг / диск), тетрациклин (30 мкг / диск), цефексим (5 мкг / диск) и азитромицин (15 мкг / диск) антибиотики (Oxoid, Великобритания ).Диаметр зоны ингибирования, создаваемой эфирным маслом, а также каждым диском с антибиотиками, измеряли и интерпретировали на основе протокола Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) [22]. S. aureus ATCC 25923 использовали в качестве микроорганизма для контроля качества при определении чувствительности к противомикробным препаратам.

Статистический анализ

Противомикробные эффекты C. officinalisflowers и каждого противомикробного агента были протестированы 3 раза. Результаты были перенесены в электронную таблицу Microsoft Excel (Microsoft Corp., Редмонд, Вашингтон) для анализа. Статистический анализ был выполнен с использованием программного обеспечения SPSS / 19.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс) для выявления значительной взаимосвязи между чувствительностью к антибиотикам штаммов MRSA при госпитальных инфекциях. В этом исследовании были выполнены критерий хи-квадрат и точный двусторонний критерий Фишера. Статистическая значимость оценивалась при значении P <0,05.

Результаты и обсуждение

Из 400 образцов госпитальных инфекций, собранных из образцов различных типов госпитальных инфекций в медицинских центрах и больницах Ирана, 100 образцов (25%) были положительными на присутствие MRSA.Присутствие гена mecA было идентифицировано во всех изолятах MRSA госпитальных инфекций с использованием метода ПЦР. На рисунке 1 показаны результаты гель-электрофореза для амплификации гена mecA .

Частота химических компонентов при различных обработках эфирного масла C. officinalis приведена в таблице 1. Всего в эфирном масле цветков C. officinalis было обнаружено 40 различных химических компонентов. Контрольная группа C. officinalis содержала наиболее изменчивые химические компоненты: всего 1,8-цинеол (30,456%), γ-терпинен (25,547%), терпинолен (4,584%), α-терпинеол (4.490%) и транс-β-оцинен (4,153%) были наиболее часто обнаруживаемыми компонентами в контрольной группе. Повышение уровня 1,8-цинеола, транс-β-оцинена, α-копаена, α-бурбонена, α-терпинилацетата, β-бисаболена, спатуленола, α-кадинола, γ-кадинена, α-кадинена и α-бисаболола. в группе C. officinalis , обработанной навозом мочевины, 1,8-цинеолом, транс-β-оциненом, α-копаеном, α-терпинилацетатом, α-мууролином, спатуленолом, γ-кадиненом, α-кадиненом и T- мууролол в группе, получавшей биологический навоз и, наконец, 1,8-цинеол, транс-β-оцинен, α-копаен, α-терпинилацетат, β-бисаболен, спатуленол, β-эудесмол, α-кадинол, γ-кадинен, α -кадинен и α-бисаболол в группе, получавшей как мочевину, так и биологические удобрения, были значительными ( P <0.05).

Таблица 1: Частота химического состава различных обработок эссенции Calendula officinalis .

В таблице 2 представлена ​​картина чувствительности к антибиотикам штаммов MRSA, выделенных при госпитальных инфекциях, против различных видов лечения C.officinalis эфирное масло. Мы обнаружили, что контрольная группа имела самые высокие антимикробные эффекты на штаммы MRSA клинических образцов человека, за которыми следовали препараты № 3 и 2. Лечение № 1 имело наименьшие антимикробные эффекты. С другой стороны, распространенность восприимчивости к MRSA по сравнению с контрольной группой, обработками № 3, 2 и 1 составляла 45%, 30%, 24% и 18% соответственно ( P <0,05). Штаммы MRSA обладали наивысшими уровнями устойчивости к лечению № 1 (41%), за которым следовали препараты № 2 (40%) и 1 (36%).Статистически значимая разница наблюдалась между типами C. officinalis и распространенностью устойчивости ( P <0,05).

Таблица 2: Профиль чувствительности к антибиотикам штаммов MRSA, выделенных при госпитальных инфекциях, против различных обработок экстрактами метанола Calendula officinalis .

В таблице 3 показана чувствительность к антибиотикам штаммов MRSA, выделенных при госпитальных инфекциях, против обычно используемых антибиотиков.Мы обнаружили, что штаммы MRSA обладают наивысшими уровнями устойчивости к тетрациклину (95%), ампициллину (92%), пенициллину (90%), гентамицину (88%) и ципрофлоксацину (77%). Штаммы MRSA обладают самой высокой чувствительностью к имипенему (95%), азитромицину (76%), котримоксазолу (66%), клиндамицину (65%) и линкомицину (59%). Также наблюдалась значительная разница между типами диска с антибиотиками и структурой устойчивости к антибиотикам ( P <0,05). Чувствительность к антибиотикам препарата № 3 из C.officinalis был полностью выше, чем у тетрациклина, ампициллина, пенициллина, гентамицина, цефексима и ципрофлоксацина ( P <0,05).

Таблица 3: Профиль чувствительности к антибиотикам штаммов MRSA, выделенных при госпитальных инфекциях, против обычно используемых антибиотиков.

Насколько нам известно, настоящее исследование является первым отчетом о распространенности химического состава и антимикробных эффектов различных обработок C.officinalis на штаммах MRSA, изолятах от различных типов госпитальных инфекций. Как уже говорилось, 25% проб были положительными на MRSA, что было существенно выше. Чрезвычайное, однобокое и неизбирательное назначение метициллина, а также других типов противомикробных средств является основными причинами высокой распространенности штаммов MRSA в образцах клинических инфекций. Загрязнение больничной среды и несоблюдение личной гигиены, особенно у пациентов, являющихся носителями штаммов MRSA, является еще одной причиной высокой распространенности MRSA.Другой причиной может быть недостаток подходящего дезинфицирующего средства.

штаммов MRSA из нашего исследования обладали высочайшим уровнем устойчивости к антибиотикам тетрациклина, ампициллина, пенициллина, гентамицина, цефексима и ципрофлоксацина, что было аналогично результатам различных ранее опубликованных статей [23-29]. Все эти исследования предложили синтез, состав и применение новых противомикробных агентов для преодоления возникновения высокой устойчивости к антибиотикам у штамма MRSA клинических образцов человека и даже животных.

Мы обнаружили, что обогащение сельскохозяйственных почв химическими и биологическими удобрениями может изменить химические компоненты эфирного масла, извлеченного из них. Однако разнообразие химических компонентов и даже процент некоторых из них в контрольной группе, которая росла в нормальных условиях, были выше, чем у химических, биологических и обеих групп, но уровни некоторых конкретных компонентов были увеличены. Итого 1,8-цинеол, β-бисаболен, транс-β-оцинен, α-копаен, спатуленол, α-бурбонен, α-терпинилацетат, T-мууролол, α-мууролен, α-кадинол, γ-кадинен, α -кадинен, β-эудесмол и α-бисабололхимические компоненты были увеличены в эфирных маслах групп лечения по сравнению с контролем.Однако противомикробные эффекты контрольной группы были выше, чем у других видов лечения, но мы обнаружили, что устойчивые к антибиотикам штаммы MRSA имели более высокую чувствительность к лечению № 3, чем контрольная группа ( P <0,05). При этом антимикробный эффект контрольной группы был выше, чем у препаратов № 2 и № 1 ( P <0,05). Похоже, что применение как биологических, так и химических удобрений может улучшить противомикробные эффекты C. officinalis против MRSA.

В исследовании, проведенном Davary Panah и Farahvash (2014) [30], влияние биологических и химических удобрений было значительным ( P <0,01 и P <0,05) на все параметры C. officinalis . (высота растения, диаметр стебля, эфирное масло, общий свежий вес и общий сухой вес). Y показал, что наибольшее количество эфирного масла было получено в группе, обогащенной нитроксиновыми удобрениями и удобрениями на основе мочевины, что было похоже на наши результаты.Rafiee et al. (2013) (31), Rahmani et al. (2009) (32), Bieski et al. (2013) (33), Jevdovic et al. (2013) (34) и Arab et al. (2015) (35) сообщили о схожих результатах. К сожалению, опубликованных данных о влиянии удобрений на химические компоненты эфирного масла C. officinalis нет.

В исследовании, проведенном Efstratiou et al. (2012) [14], результаты показали, что экстракты C. officinalis обладают исключительной антибактериальной активностью против Pseudomonas aeruginosa , Bacillus cereus , Escherichia coli , Staphylococcus aureus , Klebsiellaaerogenes , Enterocaliscalisoccus Клебсиеллапневмония .Chakraborthy (2008) [36] сообщил, что самые низкие значения минимальной ингибирующей концентрации (MIC) C. officinalis наблюдались для экстракта этанола, экстракта хлороформа, водного экстракта и экстракта петролейного эфира против бактерий. Они показали, что экстракты листьев C.officinalis были значительно эффективны против как грамположительных, так и грамотрицательных организмов. О подобных исследованиях высоких антимикробных эффектов препарата C. officinalis на патогенные бактерии сообщалось ранее Faria et al.(2011) [37] (Бразилия), Bissa and Bohra (2011) [38] (Индия) и Rigane et al. (2013) [39] (Тунис). Высокий антимикробный эффект препарата C. officinalis обусловлен его антимикробными химическими компонентами. Недавнее исследование показало, что тритерпеноид, такой как календулагликозид, тритерпеноидный сапонин, такой как фарадиол, асорамнетин3-O-неогесперидозид, кверцетин и изорамнетин, являются основными химическими компонентами C. officinalis , которые отвечают за антиоксидантные, противораковые, противомикробные, противомикробные и противовоспалительные свойства. ранозаживляющие эффекты [40].Фактически, внесение биологических и химических удобрений привело к увеличению уровней этих химических компонентов C. officinalis . Другие исследователи показали, что способ антимикробного действия C. officinalis может быть связан с его способностью инактивировать микробные ферменты, ингибировать ДНК-гиразу, подавлять функцию цитоплазматической мембраны [41, 42].

Результаты документированных отчетов показали, что основными соединениями календулы являются тритерпеноиды [43, 44], которые считаются наиболее важными противовоспалительными и противомикробными компонентами растения.Другие составляющие календулы, такие как сапонины, питательные микроэлементы, флавоноиды и полисахариды, также могут быть ответственны за противомикробный, противовоспалительный, антиоксидантный и ранозаживляющий эффект растения [43-45]. Антимикробная активность эфирного масла C. officinalis объясняется его основными химическими компонентами, включая цитраль (альдегид), гераниол (первичный спирт), эвгенол (фенол), ментол (вторичный спирт) и коричный альдегид (альдегид) [46] .Такие соединения, как линалоол, цитраль, гераниол или тимол, являются более антисептическими агентами в эфирном масле C. officinalis [47].